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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Sezione Screening per la presenza di placche colorate con metossi-X04
- Con l'aiuto di un atlante cerebrale stereotassico di topo, selezionare sezioni cerebrali contenenti la regione di interesse, ad esempio l'ippocampo CA1 come utilizzato nel presente esempio. Posizionare ogni sezione in un pozzetto all'interno di una piastra di coltura a 24 pozzetti contenente una quantità sufficiente di soluzione crioprotettiva in modo da evitare che le sezioni si secchino.
- Esaminare ogni sezione in successione per evitare di seccare le sezioni utilizzando la seguente procedura:
- Aggiungere una goccia di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a un vetrino da microscopio con una pipetta monouso e posizionare la sezione sulla gocciolina.
- Esaminare la sezione al microscopio a fluorescenza per identificare le regioni contenenti placche Aβ marcate con metossi-X04.
Nota: metossi-X04 può essere facilmente visualizzato utilizzando un filtro ultravioletto a fluorescenza (UV) (eccitazione 340 - 380 nm).
- Cattura immagini di regioni di interesse (ROI) in campo chiaro e in modalità fluorescenza senza spostare il tavolino del microscopio, poiché ogni immagine deve mostrare la stessa regione in entrambi i campi per correlare la presenza delle placche direttamente alla regione strutturale della sezione di tessuto.
- Salva e assegna un nome alle immagini scattate in base al numero dell'animale. Registrare anche il numero del pozzo nella targa e il campo delle foto scattate. Ad esempio, Es: 9978A1B; Numero animale: 9978; Pozzo numero: A1; Campo: Luminoso. Riposizionare la sezione nel pozzetto designato una volta completata l'imaging.
Nota: Alla fine, per ogni sezione esaminata, si ottengono due immagini, una in campo chiaro e un'altra in campo UV. - Apri le due immagini della stessa ROI (una in campo chiaro e l'altra in campo UV) nell'immagine J e, utilizzando il plug-in MosaicJ, allinea i bordi delle due immagini e salva l'immagine allineata e combinata in base al numero di pozzetti da cui proviene.
- Salva l'immagine in una cartella separata con il numero dell'animale in questione. Combina le immagini per identificare e localizzare le placche nella sezione di tessuto e avere una visione completa di tutta la sezione nei due diversi campi (luminoso e UV).
- Al termine del processo di screening, conservare le sezioni esaminate a -20 °C in una piastra di coltura a 24 pozzetti contenente crioprotettore fino a quando non viene eseguita l'immunocolorazione o un'ulteriore elaborazione.