Visualizzazione di un trombo cerebrale in un topo mediante imaging con tomografia microcomputerizzata

Abstract

Fonte: Kim, D., et. al. Imaging fluorescente nel vicino infrarosso combinato e tomografia microcomputerizzata per la visualizzazione diretta dei tromboemboli cerebrali. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video dimostra la visualizzazione del trombo cerebrale nei topi utilizzando l'imaging con tomografia micro-computerizzata (micro-CT). Un modello murino di trombo cerebrale viene iniettato con nanoparticelle d'oro mirate alla fibrina che fungono da agente di contrasto. Il mouse viene posizionato sul letto di una macchina micro-CT e le immagini vengono acquisite da più angolazioni. Utilizzando un software appropriato, le immagini vengono ricostruite ed elaborate.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione di un coagulo formato esogenamente marcato con un marcatore di fluorescenza (Figura 1)

1. Anestetizzare un topo in una camera di induzione utilizzando isoflurano al 3% miscelato con ossigeno al 30% (1,5 L/min 100% di ossigeno). Garantire un'adeguata profondità dell'anestesia osservando il tono muscolare e confermando l'assenza del riflesso di pizzicamento delle dita.
2. Posizionare l'animale su un telo sterile in posizione prona e tenerlo sotto anestesia utilizzando una maschera per inalazione e isoflurano al 2% miscelato con ossigeno al 30%. Eseguire le seguenti procedure utilizzando tecniche asettiche e camici/maschere/guanti/strumenti sterili. Mantenere le condizioni sterili pulendo e sanificando l'area sperimentale con alcol al 70% prima e dopo le procedure.
3. Raccogliere circa 300 ~ 1.000 μl di sangue arterioso dopo la puntura cardiaca. Miscelare 70 μl di sangue intero con una sonda C15 da 30 μl (concentrazione di 20 μmol/L), una sonda fluorescente Cy5.5 sensibile all'attività di reticolazione della fibrina dell'enzima della coagulazione del fattore XIII attivato (FXIIIa), per marcare in modo fluorescente il coagulo (Figura 1A). Iniettare il sangue miscelato utilizzando una siringa da 3 ml (ago calibro 23) in un tubo di polietilene lungo 20 cm (PE-50, D.I. 0,58 mm). I tubi in PE devono essere sterilizzati (o certificati sterili dal produttore) e i coaguli devono essere preparati in modo asettico in una cappa di coltura tissutale.
4. Verificare la morte dell'animale osservando la mancanza di respirazione e polso cardiaco.
5. Lasciare la provetta caricata con il sangue a temperatura ambiente per 2 ore, quindi a 4 °C per 22 ore ed eseguire le seguenti procedure, come precedentemente riportato.
6. Tagliare il tubo contenente trombo in pezzi lunghi 1,5 cm. Utilizzando una siringa da 3 ml riempita con soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS), espellere il trombo su una piastra a 6 pozzetti contenente PBS iniettando delicatamente PBS in ciascun pezzo di provetta. Lavare i trombi tre volte con PBS (Figura 1B).
7. Caricare la parte terminale distale di un tubo PE-10 lungo 15 cm (diametro interno 0,28 mm) con un trombo lungo 1,5 cm aspirando con cura il trombo lavato, evitando bolle d'aria, utilizzando una siringa da 1 ml riempita di soluzione fisiologica con un ago calibro 30 inserito nell'estremità prossimale del tubo.
8. Collegare il tubo PE-10 caricato con trombo con un tubo PE-50 lungo 3 cm (diametro interno 0,58 mm) modificato per avere un'estremità conica (diametro interno 200 μm), che verrà posizionato sull'area di biforcazione dell'arteria cerebrale media (MCA) – arteria cerebrale anteriore (ACA) dell'arteria carotide interna (ICA) in un modello murino di ictus embolico (Figura 1C).

2. Modellazione di un modello murino di ictus tromboembolico (Figura 2)

1. Anestetizzare un altro topo da accarezzare in una camera di induzione utilizzando isoflurano al 3% miscelato con ossigeno al 30% (1,5 L/min). Iniettare meloxicam (5 mg/kg) per via sottocutanea per alleviare il dolore post-operatorio. Garantire un'adeguata profondità dell'anestesia osservando il tono muscolare e confermando l'assenza del riflesso di pizzicamento delle dita.
2. Applicare una piccola quantità di unguento veterinario su ciascun occhio per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Eseguire le seguenti procedure chirurgiche utilizzando tecniche asettiche e camici/maschere/guanti/strumenti sterili. Mantenere le condizioni sterili pulendo e igienizzando l'area chirurgica con alcol al 70% prima, durante e dopo l'intervento.
3. Spostare il mouse su un tavolo operatorio. Posizionare l'animale su un telo sterile in posizione prona e tenerlo sotto anestesia utilizzando una maschera per inalazione e isoflurano al 2%. Quindi, bloccare la temperatura corporea a 36,5 °C utilizzando una coperta omeotermica con feedback da un termometro rettale.
4. Dopo la preparazione chirurgica con betadina e alcol al 70%, praticare un'incisione verticale di 1 cm utilizzando un bisturi sul cuoio capelluto tra l'orecchio sinistro e l'occhio. Incollare l'estremità distale della fibra ottica di un flussimetro laser Doppler sulla superficie esposta dell'osso temporale sinistro (1 mm a sinistra e 4 mm sotto il bregma). Quindi, avviare il monitoraggio del flusso Doppler (Figura 2A).
5. Sdraia l'animale. Raddrizzare il collo tirando il dente anteriore superiore con una corda attaccata a uno spillo e radere la zona del collo. Quindi, praticare un'incisione verticale della linea mediana di 3 cm, aprirla ed esporre l'area del bulbo carotideo sinistro sezionando i tessuti molli perivascolari. Fare attenzione a non ferire il nervo vago.
6. Legare l'arteria carotide comune prossimale sinistra (CCA) utilizzando una sutura sterile di seta nera 6-0 e legare l'ICA sinistro e l'arteria pterigopalatina sinistra (PPA) utilizzando suture sterili di seta nera 7-0.
7. Cauterizzare l'arteria tiroidea superiore sinistra, che è un ramo dell'arteria carotide esterna sinistra, utilizzando un cauterizzato elettrico monopolare, e legare l'arteria carotide esterna prossimale sinistra (ECA) in modo lasco e il sito più distale strettamente utilizzando suture di seta nera sterili 7-0.
8. Utilizzando una microforbice, praticare un piccolo foro (circa 0,2 ~ 0,25 μm di diametro) tra i siti legati dell'ECA.
9. Inserire il catetere contenente trombo nel foro dell'ECA mentre si allenta la legatura prossimale dell'ECA. Stringere nuovamente la legatura ECA prossimale dopo aver fatto avanzare il catetere nel CCA per stringere il catetere in posizione.
10. Cauterizzare per tagliare la parte distale dell'ECA, che è distale rispetto al sito di legatura distale, e ruotare l'ECA prossimale libera in senso orario per allinearla alla direzione dell'ICA mentre si estrae il catetere dal CCA. Quindi, far avanzare il catetere di circa 9 mm nell'area di biforcazione MCA-ACA dell'ICA distale subito dopo aver allentato la legatura ICA. Quindi, stringere la legatura ICA.
11. Posizionare il trombo nell'area della biforcazione premendo delicatamente la siringa da 1 ml per iniettare il trombo. Controllare la diminuzione del flusso sanguigno cerebrale Doppler (CBF), che dovrebbe essere ridotta del 30% o meno rispetto al basale, se il trombo ha occluso con successo il vaso (Figura 2B).
12. Rimuovere il catetere e legare immediatamente e saldamente il sito prossimale dell'ECA. Inoltre, annullare la CCA e il PPA.
13. Chiudere il sito di incisione utilizzando suture di seta 6-0. Interrompere l'anestesia dopo aver continuato il monitoraggio Doppler per un periodo di tempo richiesto (qui, per 30 minuti dopo l'iniezione del trombo). Rimetti il mouse in una gabbia vuota e tienilo al caldo con una lampada riscaldante. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non ha acquisito sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.

3. Imaging MicroCT in vivo del trombo cerebrale (Figura 3)

1. Anestetizzare nuovamente il topo con isoflurano al 2% come descritto nel passaggio 2.1 in un punto temporale pre-specificato (qui, 1 ora) dopo l'insorgenza dell'ictus embolico dovuto al posizionamento del trombo nell'arteria cerebrale. Garantire un'adeguata profondità dell'anestesia confermando l'assenza del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi. Applicare una piccola quantità di unguento veterinario su ciascun occhio per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
2. Risospendere le nanoparticelle d'oro mirate alla fibrina (fib-GC-AuNP4) a una concentrazione di 10 mg Au/ml in 10 mM PBS e sonicare l'agente di imaging del trombo per 30 minuti per garantire la dissoluzione e la dispersione delle nanoparticelle. Iniettare 300 μl di fib-GC-AuNP (10 mg/ml) nella vena del pene.
3. Posiziona l'animale sul letto di una macchina microCT e raddrizza il collo tirando il dente anteriore superiore con una corda attaccata a un perno per ridurre gli artefatti di movimento.
4. A 5 minuti dall'iniezione di fib-GC-AuNP, iniziare a ottenere immagini micro-CT del cervello. Per gli esperimenti qui descritti, utilizzare i seguenti parametri di imaging: 65 kVp, 60 μA, 26,7 x 26,7 x 27,9 mm³ campo visivo, 0,053 x 0,053 x 0,054 mm³ dimensioni voxel, 100 millisecondi per fotogramma, una media, 360 visualizzazioni, matrice di ricostruzione 512 x 512, 600 sezioni, tempo di scansione 64 secondi.
5. Rimetti il mouse in una gabbia vuota e tienilo al caldo con una lampada riscaldante. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non ha acquisito sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.
6. Trasforma i dati grezzi dell'immagine in formato DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine) utilizzando il comando "Start" del pannello "Ricostruzione" in un pacchetto software installato sullo scanner micro-CT.
7. Per l'analisi quantitativa delle immagini (al punto 6), trasformare i dati DICOM in formato TIFF utilizzando un pacchetto software disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore.
8. Per analisi qualitative e quantitative in modo più semplice e rapido, utilizzare il pacchetto software e le immagini originali di 0,054 mm di spessore in formato DICOM per generare un nuovo set di immagini assiali e coronali renderizzate con uno spessore di 1 o 2 mm (in questo caso, 2 mm), come segue.
   1. Seleziona la cartella DICOM nell'albero 'Sorgente dati', fai clic con il tasto destro del mouse e importa la cartella in 'MasterDB' o 'PrivateDB.'
   2. Fai clic su "MasterDB" o "PrivateDB" nell'albero "Origine dati" e seleziona la cartella importata. Dopo aver fatto clic sulla scheda "3D" nel pannello più a sinistra, quando viene visualizzata la finestra "Opzioni di caricamento", premere "OK" per importare una sequenza di immagini nella cartella come pila.
   3. Modificare la rappresentazione dell'immagine nel formato di proiezione a massima intensità (MIP) facendo clic sulla parola "MRP" nelle finestre dell'immagine assiale e coronale e scegliendo "MIP" dal menu a comparsa. Quindi, modificare lo spessore dell'immagine a 2 mm dopo aver fatto clic su "TH : 0 [mm]" nella stessa finestra.
   4. Utilizzando la barra del navigatore 3D di 2 mm di larghezza che consente di esplorare una pila di immagini e di sezionarla con un'angolazione e una posizione appropriate, preparare un'immagine in sezione assiale di 2 mm di spessore con una copertura completa del cerchio di Willis (COW), che ospita i trombi. Fai clic sul pulsante di acquisizione (icona della fotocamera) nel pannello "Output". Salva l'immagine in formato TIFF.
9. Quindi, prepara cinque immagini di sezione coronale spesse 2 mm che coprono contiguamente dal lobo frontale al cervelletto.
   1. Innanzitutto, preparare la seconda fetta allineando attentamente la barra del navigatore sull'immagine assiale in modo che l'immagine coronale possa visualizzare al meglio i trombi MCA-ACA.

Successivamente, preparate le altre quattro fette in modo contiguo. Fai clic sul pulsante di acquisizione (icona della fotocamera) nel pannello "Output". Salva le immagini in formato TIFF.

Risultati

Figura 1: Panoramica della preparazione di un coagulo di sangue marcato con fluorescenza. (A) Miscelazione di sangue intero fresco con sonda fluorescente nel vicino infrarosso (NIRF) Cy5.5 (C15) che è legata in modo covalente ai filamenti di...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo Nome Azienda Numero di catalogo Commenti Macchine microCTNanoFocusRay, JeonJu, CoreaNFR Polaris-G90 Laser Doppler flowmeterPerimed, Stoccolma, SveziaPeriFlux System 5000 Microscopio operatorioLeica Microsystems, Seoul, CoreaEZ4HD Macchina per anestesia per inalazionePerkinElmer, Massachusetts, USAXGI-8 Software di controllo NFRNanoFocusRay, JeonJu, Corea Software di controllo microCT NFR Polaris-G90LucionInfinitt, Seoul, CoreaLucion3D render imaging softwareLab chart 7ADInstruments, Colorado, USALab chart 7rCBFImage J softwareWanye Rasband, NIH, USA1.49dimaging analysisDispositivi/Strumenti Pompa di infusioneHarvard, Massachusetts, USApompa 22( 55-2226) Coperta omeotermicaPanlab, Barcellona, SpagnaHB101 Cauterizzazione tascabileDaejong, Seoul, CoreaDJE-39 Matrice cerebraleTed pella, CA, USA15003sezione coronalePE-50 tuboNatsume, Tokyo, GiapponeSP-45 (PE-50) ID 0,58 mm Diametro esterno 0,96 mmTubo PE-10Natsume, Tokyo, GiapponeSP-10 (PE-10) ID 0,28 mm OD 0,61 mm30 gauge agosungshim-medical, Seoul, Corea SiringaCPL-medical, Ansan, Corea 1 e 3 ccGarzaPanamedic, Cheonan, Corea TapeScotch, Seoul, Corea3M-810 Micro pinzeFine Science Tools, Vancouver, Canada11253-27Dumont #L5Micro forbiceFine Science Tools, Vancouver, Canada15000-03Vannas springScissor FineScience Tools, Vancouver, Canada14084-088,5 cmSutura in seta neraAilee, Busan, CoreaSK6071, SK7286-0 e 7-0Reagenti MeloxicamYuhan, Seoul, Corea Unguento veterinarioNovartis, Basilea, Svizzera 10% iodio povidone (betadina)Firson, Cheon-an, Corea Cloruro ferricoSigma, Missouri, Stati Uniti157740-5G TTCAmresco, Ohio, USA0765-100g IsofluranoHana-Pham, Gyeonggi, CoreaIfran100 mLPBSWelgene, Daegu, CoreaLB001-02500 mL Nanoparticelle d'oro SintesiSoluzione salina normaleDaihan Pham, Seoul, Corea48N3AF320 mL