Registrazione e colorazione juxtacellulare per una mappatura precisa dell'attività neurale in un ratto sveglio

Abstract

Fonte: Moore, J. D., et al. Monitoraggio juxtacellulare e localizzazione di singoli neuroni all'interno di strutture cerebrali subcorticali di ratti allertati e con la testa trattenuta. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video mostra il metodo di registrazione e colorazione juxtacellulare in un ratto sveglio e trattenuto. La procedura prevede la registrazione dei segnali dai neuroni e l'iniezione di colorante per localizzare con precisione il sito di registrazione. Questa tecnica consente di mappare con precisione l'attività neurale nella struttura anatomica del cervello.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Monitoraggio iuxtacellulare delle unità neuronali

1. Estrarre un tubo capillare di quarzo su un estrattore laser per micropipette ad anidride carbonica (vedere la sezione Materiali) con diametri della punta inferiori a 1 μm (Figura 2A).
   NOTA: I parametri di riscaldamento varieranno a seconda dello strumento particolare e che il diametro del collo richiesto varierà a seconda della struttura cerebrale di interesse. Per le registrazioni nel talamo di ratto, le micropipette hanno colli che vanno da 5 a 7 mm.
2. Fissare la pipetta in posizione sotto un microscopio a contrasto interferenziale differenziale (DIC) dotato di obiettivi a lunga distanza di lavoro. Utilizzare l'argilla da modellare per tenere la pipetta in posizione sul tavolino del microscopio.
3. Spostare lentamente un blocco di vetro (0,5 - 1 cm di spessore; un pezzo di vetro utilizzato per realizzare coltelli ultra-microtomo è conveniente) nel campo visivo con la punta della pipetta. Utilizzando il micromanipolatore da tavolino, toccare delicatamente la punta della pipetta con il bicchiere, provocandone la rottura. Ripetere l'operazione fino a quando il diametro esterno del puntale della pipetta è compreso tra 1 e 3 μm (Figura 2B, C). Assicurarsi che queste micropipette abbiano impedenze comprese tra circa 5-15 MΩ.
4. Preparare soluzione salina extracellulare (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES (acido 4-(2-idrossietil)piperazina-1-etansolfonico), pH 7,2 con NaOH) e aggiungere il 2% (p/v) di Chicago Sky Blue. Riempire l'estremità posteriore della pipetta con la soluzione utilizzando una siringa con ago da 30 G o più piccolo. In alternativa, per la marcatura iuxtacellulare a singola cellula, aggiungere il 2% (p/v) di neurobiotina o destrano ammina biotinilato (BDA-3000 o BDA-10000) alla soluzione salina al posto di Chicago Sky Blue.
5. Posiziona il ratto all'interno della calza di stoffa all'interno del tubo rigido su una maschera sperimentale appropriata (Figura 1). Attendere almeno 72 ore dopo l'intervento chirurgico prima di posizionare l'animale sulla dima di ritenuta della testa. Stringere il cordoncino attorno allo sterno superiore, piuttosto che al collo, per evitare l'ostruzione delle vie aeree. Se la respirazione sembra essere affannosa o ostruita, allentare il cordoncino o spostarlo posteriormente. Eseguire questa procedura mentre il ratto è allerta.
6. Fissare la piastra di contenimento della testa sul ratto al pezzo corrispondente sulla maschera. Per fare ciò, prima fissare la piastra di ritenuta in posizione, quindi fissarla con una vite 4-40. Assicurati di aspettare che l'animale sia calmo per evitare di applicare una coppia eccessiva alla testa. Quindi, posiziona un dado 8-32 sul bullone di contenimento della testa che viene impiantato nel ratto. Quindi avvitare un'asta filettata in acciaio inossidabile al bullone della testa. Fissare l'asta alla maschera sperimentale in modo tale che possa essere serrata in posizione (Figura 1).
   NOTA: Fissare l'animale con il bullone della testa e la piastra di ritenuta della testa riduce al minimo la flessione dell'apparecchio e migliora la stabilità della registrazione. Nella maggior parte dei casi, la registrazione può iniziare il primo giorno in cui l'animale viene immobilizzato con la testa. Tuttavia, se l'animale si agita eccessivamente o vocalizza, fornire un giorno di addestramento all'abitudine al poggiatesta prima di iniziare qualsiasi registrazione. In questo caso, lasciare l'animale sul jig per 15 minuti e poi rimetterlo nella sua gabbia. Ripetere questo passaggio il giorno successivo e continuare con il protocollo.
7. Aprire la camera di registrazione e rimuovere il gel di silicone. Se il tessuto è ricresciuto nella craniotomia, pulirlo con una pinza fine.
8. Collegare la pipetta al micromanipolatore motorizzato e collegare il preamplificatore dell'headstage.
   NOTA: Nella presente dimostrazione, un piccolo circuito di relè sullo stadio principale commuta tra i fili conduttori dell'amplificatore e una sorgente di corrente esterna con elevata conformità (Figura 3A-C). Si noti che alcuni amplificatori hanno un'appropriata sorgente integrata ad alta conformità.
9. Utilizzare il micromanipolatore motorizzato per spostare la punta della pipetta sul segno identificato stereotassicamente nella camera di registrazione. Prendi nota delle coordinate di questa posizione. Fare attenzione a non rompere la punta della pipetta sul cranio.
10. Spostare la pipetta nella posizione di registrazione desiderata sugli assi antero-posteriore e mediolaterale. Quindi far avanzare la pipetta ventralmente attraverso la dura madre fino a quando non si trova a circa 500 μm dorsali rispetto alla posizione di registrazione prevista.
11. Far avanzare lentamente la pipetta mentre si ascoltano gli eventi di picco su un monitor audio della tensione amplificata registrata tra la punta della pipetta e il filo di riferimento. Una volta identificati gli eventi di picking, continuare a muovere la pipetta da 0 a 100 μm fino a quando non si osservano deflessioni di tensione positive superiori a circa 500 μV.
    NOTA: La resistenza dell'elettrodo aumenterà di un fattore di circa 1,5-10 quando ciò si verifica.
12. La registrazione dovrebbe iniziare una volta che un'unità è stata isolata, insieme a tutte le altre misure comportamentali e fisiologiche di interesse. Nella presente dimostrazione, i movimenti autogenerati delle vibrisse sono monitorati con videografia ad alta velocità (vedi Materiali ).
13. Per etichettare il sito di registrazione, cambiare i cavi degli elettrodi per collegarli alla sorgente di corrente. Ci sono diversi modi per farlo, utilizzando un circuito relè(Figura 3A-C), una sorgente di corrente incorporata nell'amplificatore, o manualmente(Figura 3D). Passare -4 μA con impulsi di 2 secondi al 50% del ciclo di lavoro per 4 minuti per iniettare ionoforeticamente Chicago Sky Blue attraverso la pipetta.
14. Uccidere e perfondere l'animale dopo diverse procedure di etichettatura secondo la pratica standard. Sezionare il cervello e controcolorare se necessario per identificare la posizione anatomica del sito di registrazione. Controcolorare il tessuto per la reattività alla citocromo ossidasi. In alternativa, identificare i depositi di Chicago Sky Blue utilizzando la microscopia a fluorescenza.
    NOTA: Per distinguere con precisione tra le diverse unità etichettate, è importante che tutte le etichette siano realizzate con la stessa pipetta nello stesso giorno, senza sganciare la pipetta tra le etichette. In questo caso, i siti di registrazione possono essere differenziati in base alle loro posizioni relative nell'istologia post-hoc, insieme alle coordinate del manipolatore annotate di ciascun sito. Per un'identificazione univoca, contrassegnare le etichette ad almeno 200 μm di distanza l'una dall'altra e non più di 3-5 etichette per regione del cervello.

Risultati

Figura 1: Dima sperimentale. Schema del ratto nella maschera meccanica per esperimenti di monitoraggio elettrofisiologico e comportamentale. La maschera utilizza la barra e la piastra

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ketaset (Ketamine HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (soluzione di xilazina)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidone-Iodio)	CVS Pharmacy	269281
Loctite 495	Grainger Industrial Supply	4KL86	20-40 cp cianoacrilato
Vetbond	3M	1469SB
Grip polvere di cemento	Dentsply Intl	675571	Per la base della camera di registrazione
Grip liquido cementizio	Dentsply Intl	675572	Per la base della camera di registrazione
Gel siliconico	Dow Corning	Mar-80
Polvere acrilica per riparazione di protesi dentarie a getto	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	Per fissare l'apparecchio di ritenuta della testa al cranio
Ortho-Jet Liquido di resina acrilica ortodontica a polimerizzazione rapida	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	Per il fissaggio dell'apparato di ritenuta della testa al cranio
Chicago sky blue	Sigma	C8679
Paraformaldeide	Sigma	158127	Per perfusione e fissazione tissutale
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma	P3813	Per perfusione e fissazione tissutale
Citocromo C	Sigma	C2506
Diaminobenzidina	Sigma	D5905
Calza di ratto	cucire elegante (San Diego, CA)	N / A
tubo in PVC 2 1/2 "	U.S. Plastic Co.	34108
Pin e prese D subminiaturizzati	TE Connectivity	205089-1
Filo musicale in acciaio inossidabile diametro 0,010"	Precision Brand Products, Inc.	21010
Telaio di supporto stereotassico	Kopf Instruments	Modello 900
Barre auricolari stereotassiche	Kopf Instruments	Modello 957
Manipolatore stereotassico	Kopf Instruments	Modello 960
Fresa da trapano da 1/2 mm	Henry Schein	100-3995
Trapano odontoiatrico Quiet-Air	Midwest Dental	393-1600
Vite in acciaio inox 0-80 1/8"	Dispositivo di fissaggio superstore	247438
provetta da centrifuga da 0,2 ml	Fisher Scientific	05-407-8A
Barra portatesta personalizzata	UCSD SIO Officina meccanica	N/A Morsetto
per perno ad angolo retto	Newport	MCA-1
8-32 3/4" vite	Fastener Superstore	240181
4-40 1/4" vite	Fastener Superstore	239958
Tubo capillare al quarzo	Sutter Instruments	QF-100-60-10
Micromanipolatore motorizzato	Sutter Instruments	MP-285
Amplificatore per microelettrodi	Molecular Devices	Multiclamp 700B	Parte alternativa: Molecular Devices Axoclamp 900A
Stadio principale dell'amplificatore per microelettrodi	Molecular Devices	CV-7B	Parte alternativa: HS-9Ax10 con Molecular Devices Axoclamp 900A
Stimolatore di impulsi isolato	A-M Systems	Modello 2100	Parte alternativa: HS-9Ax10 con Molecular Devices Axoclamp 900A
Monitor audio	Radio Shack	32-2040
Cavo dell'elettrodo	Filo Cooner	NEF34-1646
Relè per stadio principale dell'amplificatore	Tecnologia COTO	#2342-05-000	(opzionale) Utilizzato con un circuito stampato su misura (UCSD Physics Electronics Shop), Figura 6A-C
Videocamera digitale	Basler	A602fm
Porta pipetta	Warner Instruments	#MEW-F10T
Piastra portatesta personalizzata	UCSD SIO Machine Shop	N/A