Espansione del sangue periferico umano γδ cellule T con Zoledronato

Sommario

Un metodo per espandere γδ cellule T dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) è descritta. PBMC cellule derivate γδ T vengono stimolati e ampliati con zoledronato e interleuchina-2 (IL-2). L'espansione su larga scala di γδ cellule T possono essere applicate a autologo immunoterapia cellulare del cancro.

Abstract

Γδ cellule T in grado di riconoscere e rispondere a una vasta gamma di antigeni indotta da stress, sviluppando in tal modo innato attività ampio anti-tumorale e anti-infettivi. ¹ La maggior parte dei γδ cellule T nel sangue periferico hanno il recettore delle cellule T Vγ9Vδ2. Queste cellule riconoscono l'antigene in un complesso maggiore di istocompatibilità modalità indipendente e sviluppare una forte funzioni citolitica e Th1-come effettore. ¹ Perciò, γδ cellule T sono cellule effettrici candidato attraente per l'immunoterapia del cancro. Vγ9Vδ2 cellule T rispondere a phosphoantigens come (E)-4-idrossi-3-metil-but-2-enil pirofosfato (HMBPP), che è sintetizzata nei batteri attraverso isoprenoidi biosintesi, ² e isopentenil pirofosfato (IPP), che viene prodotto nelle cellule eucariotiche attraverso la via mevalonato. ³ In condizioni fisiologiche, la generazione di IPP ​​nella cella nontransformed non è sufficiente per l'attivazione delle cellule T γδ. Disregolazione della via mevalonato nelle cellule tumorali porta all'accumulo di IPP ​​e l'attivazione delle cellule T γδ. ³ Poiché aminobifosfonati (come pamidronato o zoledronato) inibiscono la farnesil pirofosfato sintasi (FPP), l'enzima agisce a valle di IPP ​​nella via mevalonato, i livelli intracellulari di IPP e sensitibity γδ per il riconoscimento delle cellule T possono essere terapeuticamente aumentato di aminobifosfonati. IPP accumulo è meno efficiente in cellule nontransfomred rispetto alle cellule tumorali con una concentrazione farmacologicamente rilevanti aminobifosfonati, che ci permettono l'immunoterapia per il cancro attivando γδ cellule T con aminobifosfonati ^4. Interessante, IPP si accumula nei monociti quando PBMC sono trattati con aminobifosfonati, a causa di efficienti assunzione di droghe da queste cellule ^5. monociti che si accumulano IPP diventare cellule presentanti l'antigene e stimolare Vγ9Vδ2 cellule T nel sangue periferico. ⁶ Sulla base di questi meccanismi, abbiamo sviluppato una tecnica per la grande espansione del γδ colture di cellule T con zoledronato e interleuchina -2 (IL-2). ⁷ Altri metodi per l'espansione delle cellule T γδ utilizzare il sintetico pirofosfato bromohydrin phosphoantigens (BrHPP) ⁸ o 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP) ^9. Tutti questi metodi consentono ex vivo di espansione, con conseguente gran numero di γδ cellule T per l'uso in immunoterapia adottiva. Tuttavia, solo zoledronato è un reagente approvato dalla FDA disponibili in commercio. Zoledronato espanso γδ cellule T CD27 schermo ^- CD45RA ^- fenotipo effettore memoria e la loro funzione può essere valutata da IFN-γ test di produzione ^7.

Protocollo

1. Isolamento dei PBMC

1. Prelievo di sangue (7,5-8,0 ml) in una provetta BD Preparazione Vacutainer cella CPT con eparina di sodio. Il tubo contiene un anticoagulante eparina sodica e di un Ficoll-Hypaque densità del fluido, più una barriera di gel di poliestere, che separa i due liquidi. Centrifuga tubo / campione di sangue a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) in un rotore orizzontale (swing-out testa) per 20 minuti a 1800 x g. Interruttore centrifuga freni sbloccati.
2. Dopo la centrifugazione, la sequenza di strati avviene nel seguente modo (visto dall'alto verso il basso): a) al plasma - b) le cellule mononucleate del sangue periferic....

Discussione

Il metodo presentato qui permette l'espansione delle cellule T efficiente γδ da PBMC. γδ cellule T attivate e ampliato da zoledronato e IL-2 sviluppano completa funzioni effettrici, riflessa dalla produzione di citochine e citotossicità. E 'stato riportato che il sintetico phosphoantigens pirofosfato bromohydrin (BrHPP) e 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP) anche espandere le cellule T γδ, tuttavia, non sono disponibili in commercio. Al contrario, zoledronato è già concesso in licenza per le applicazioni c.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagente nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
ZOMETA	Novartis Pharma K. K		zoledronato
Proleukin	Novartis Pharmaceuticals		umano ricombinante IL-2
BD Vacutainer CPT Preparazione del tubo cellulare con sodio eparina	BD	362753
RPMI1640	Invitrogen	21870-076
ALyS203-media	Cellula Science & Technology Institute	0301-7
OpTmizer	Invitrogen	0080022SA
Un brefeldin	Sigma	B5936-200UL
forbolo miristato 12-13-acetato (PMA)	Sigma	P1585-1MG
ionomicina	Sigma	13909-1 ml
IntraPrep	BECKMAN COULTER	A07803
anti-umano-CD3 FITC o PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07746 FITC A07749 PE/Cy5
anti-umano CD4-ECD	BECKMAN COULTER	6604727
anti-umana CD8-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	6607011
anti-umana CD14-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07765
anti-umano CD19-PE	BECKMAN COULTER	A07769
anti-umano CD45-ECD	BECKMAN COULTER	A07784
anti-umana CD56-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07789
anti-umano TCRαβ-PE	BECKMAN COULTER	A39499
anti-umano TCR Vγ9-FITC	BECKMAN COULTER	IM1463
anti-umana CD27-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	6607107
anti-umano CD45RA-ECD	BECKMAN COULTER	IM2711
anti-umano CD69-PE	BD	555531
anti-umano NKG2D-PE	BECKMAN COULTER	A08934
Anti-humal IFNγ-PE	BECKMAN COULTER	IM2717U
IgG1 isotipo di controllo-PE	BECKMAN COULTER	A07796
IgG1 isotipo di controllo-ECD o PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07797 A07798