Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale

Sommario

Un metodo affidabile per l'isolamento di RNA Pseudomonas aeruginosa Recuperato da cecums murino è descritto. L'RNA recuperato è di quantità e qualità sufficienti per qPCR successivi, profili di trascrizione, e l'RNA esperimenti Seq. Questa tecnica può essere adattata per l'isolamento di RNA di altri microbi intestinali.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (PA) causa infezioni in significativa morbidità e mortalità in host con sistema immunitario compromesso, come i pazienti affetti da leucemia, gravi ustioni, o trapianti di organi ^1. Nei pazienti ad alto rischio di sviluppare infezioni del sangue PA, il tratto gastrointestinale (GI) è il principale serbatoio per la colonizzazione ^2, ma i meccanismi con cui transizioni PA da un microbo ad una colonizzazione asintomatica invasiva, e spesso mortale, patogeno non sono chiare. In precedenza, abbiamo effettuato esperimenti in vivo profilazione trascrizione mRNA PA attraverso il recupero di cellule batteriche residenti nel cecums di topi colonizzati ^3, per identificare i cambiamenti nell'espressione genica batterica durante alterazioni dello stato immunitario dell'ospite.

Come con qualsiasi esperimento profilazione trascrizione, il fattore limitante è l'isolamento di una sufficiente quantità di mRNA di alta qualità. Data l'abbondanza di enzimi, detriti, residui di cibo, e particolato nel tratto gastrointestinale, la sfida di isolamento dell'RNA è scoraggiante. Qui, vi presentiamo un metodo per l'isolamento affidabile e riproducibile di RNA batterico recuperato dal tratto GI murino. Questo metodo utilizza un consolidato modello murino di colonizzazione PA GI e neutropenia indotta dalla diffusione ^4. Colonizzazione volta GI con PA è confermata, i topi sono contenuti eutanasia e del cieco vengono recuperati e flash congelati. L'RNA viene poi estratta usando una combinazione di distruzione meccanica, bollitura, fenolo / cloroformio estrazioni, trattamento DNase, e cromatografia di affinità. Quantità e la purezza sono confermati da spettrofotometria (Tecnologie NanoDrop) e Bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig. 1). Questo metodo di isolamento microbico GI RNA può essere facilmente adattato ad altri batteri e funghi, come pure.

Protocollo

1. Modello murino di P. aeruginosa GI colonizzazione e diffusione

1. Topi C3H/HeN (6-8 settimane vecchio, femmina, Harlan) sono trattati con antibiotici per via orale ad esaurire flora commensale e poi mono-colonizzati da PA come descritto in precedenza ^4.

2. La raccolta murini contenuto del cieco Luminal

1. Immergere un mortaio pulito in acciaio inox in una vasca di azoto liquido.
2. Euthanize topi per asfissia di anidride carbonica.
3. Topo carcassa sicuro su una tavola di polistirolo e doccia con etanolo al 95%. Fai una incisione mediana longitudinale attraverso la pelle dallo sterno al perineo. Riflettono la pelle e peritoneo per esporre la cavità addominale.
4. Resecare il cieco intero. Tenere il cieco con una pinza sopra la malta in acciaio inox. Snip entrambe le estremità del cieco con le forbici dissezione.
5. Inserire una punta P1000 pipetta riempita con 1 ml di tampone flushate del cieco (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl) ⁵ nelle estremità prossimale del cieco. Svuotare il buffer del cieco flushate e del cieco contenuto luminale nel mortaio in acciaio inox. 1 ml di tampone flushate del cieco sarà sufficiente per il lavaggio di tutto il contenuto del cieco. Cecale contenuti flushate si blocca subito dopo entrare in contatto con la malta.
6. Macinare il contenuto flushate del cieco con un pestello sterile.
7. Terreno posto ghiacciato del cieco contenuto luminale in una provetta 50 ml conica in polipropilene immerso in un ghiaccio secco / etanolo bagno.
8. Ripetere i punti 2,2 per 2,7 per ogni mouse aggiuntivo.
9. Conservare a -80 ° C.

3. Batteriche RNA Isolation

1. Caldo 1 volume (in base al volume finale di due contenuti del cieco del lume, circa 3 ml) di acido fenolo / cloroformio (5:1, v / v) contenuta in un tubo 50 ml per centrifuga Oak Ridge con il tappo fissato in parafilm in 65 ° C acqua sporca.
2. Fate bollire 0,5 volume di tampone di lisi (2% SDS, 16 mM EDTA, 200 mM NaCl) ⁶ contenuta in un tubo in polipropilene da 50 ml conica per 5 minuti.
3. Aggiungi tampone bollente lisi del cieco a contenuto luminale. Omogeneizzare. Fate bollire per 5 minuti con vortex periodica.
4. Aggiungere i 100 ° C il contenuto del cieco / campione lisi ai 65 ° C acido fenolo / cloroformio nella provetta da centrifuga Oak Ridge. Con tappo a tenuta con parafilm.
5. Incubare a 65 ° C per 10 minuti con vortex periodico (ogni 2 minuti).
6. Centrifugare campione a 2.500 g a 4 ° per 15 minuti.
7. Con attenzione trasferimento fase acquosa (evitando qualsiasi dell'interfaccia bianco) per un nuovo 50 ml centrifuga Oak Ridge. Il volume della fase acquosa sarà circa il 50% del volume totale dei contenuti del cieco, tampone di lisi, e acido fenolo / cloroformio. Aggiungere un volume equivalente di acido fenolo / cloroformio.
8. Con tappo a tenuta con parafilm e mescolare bene nel vortex ad alta velocità.
9. Centrifugare campione a 2.500 g a 4 ° per 15 minuti.
10. Ripetere i passaggi 3,7-3,9 finché non ci sarà alcuna interfaccia visibile bianco tra le fasi acquosa e organica.
11. Con attenzione trasferimento fase acquosa in una nuova centrifuga 50 ml Oak Ridge. Aggiungere un uguale volume di cloroformio / alcool isoamilico (24:1, v / v).
12. Guarnizione tappo e mescolare bene nel vortex.
13. Centrifugare campione a 2.500 g a 4 ° per 15 minuti. Rimuovere fase acquosa (volume sarà circa il 50% del volume totale di reazione) a 15 tubo di polipropilene ml e aggiungere un uguale volume di isopropanolo.
14. Incubare a -20 ° per almeno 2 ore o durante la notte.
15. Centrifugare campione a 2.500 g a 4 ° per 45 minuti. Un gel-like pellet si forma sul fondo della provetta. Rimuovere il surnatante.
16. Lavare il pellet con 1 ml di ghiacciata etanolo al 70%. Vortex. Centrifugare a campione a 10.000 g a 4 ° per 5 minuti.
17. Rimuovere il supernatante e invertire il tubo per far asciugare il pellet a temperatura ambiente per 10 minuti.
18. Risospendere il pellet di RNA in 200 ml di acqua RNase-free.

4. DNasi Trattamento (Turbo DNA-Free, Applied Biosystems)

1. Aggiungere 20 ml di tampone 10X Turbo DNasi e 2 microlitri Turbo DNasi e mescolare delicatamente.
2. Incubare a 37 ° per 20 minuti.
3. Aggiungere 20 ml di reagente risospeso inattivazione DNasi e mescolare bene.
4. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente, mescolando di tanto in tanto.
5. Centrifugare a 10.000 g a temperatura ambiente per 1,5 minuti e trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga nuovo.
6. Aggiungere un volume di freddo (4 °) L'acido fenolo / cloroformio e mescolare accuratamente vortexando per 1 minuto.
7. Centrifugare a 12.500 g a temperatura ambiente per 2 minuti.
8. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e aggiungere 1 volume di cloroformio / alcool isoamilico (49:1 v / v), vortice.
9. Centrifugare a 12.500 g a temperatura ambiente per 2 minuti.
10. Trasferire la fase acquosa (circa il 50% del volume totale di reazione) in una nuova provetta.
11. Aggiungere 0,1 volumi di acetato di sodio 3M pH 5.5 e2,5 volumi di ghiaccio freddo etanolo al 100%. Vortex.
12. Incubare a -20 ° per almeno 2 ore oa -80 ° per 30 minuti.
13. Centrifugare a 12.000 g per 30 minuti a 4 °
14. Rimuovere il surnatante.
15. Lavare il pellet con 1 ml di ghiacciata etanolo al 70% per centrifugazione per 5 minuti a 10.000 g a 4 °.
16. Rimuovere il surnatante e l'aria secca per 10 minuti.
17. Risospendere il pellet in 100 ml di acqua RNase-free. Potrebbe essere necessario posto nel 65 ° di durezza bagno per risospendere e sciogliere il precipitato.
18. Per testare l'efficacia del trattamento DNasi, una RT-PCR, reazione standard per l'amplificazione di una proteina ribosomiale (o gene altro riferimento) potrebbe essere eseguito per campioni trattati e non trattati, con nessun controllo RT.

5. RNA sottofase di cancellazione (Qiagen, RNeasy Kit)

1. Fare riferimento alle pagine 56-57 della Qiagen RNeasy Mini Handbook (4 ^ª edizione, aprile 2006). Seguite le indicazioni fornite.

6. Rappresentante Risultati

La quantità di RNA batterico totale recuperati utilizzando questo protocollo è di circa 2-3 mg da due cecums. L'RNA recuperato è di quantità e qualità sufficienti per qPCR successivi, profili di trascrizione, e l'RNA esperimenti Seq. Purezza RNA è normalmente valutata misurando il rapporto 260nm/280nm ⁷ del campione, ma questo metodo non fornisce alcuna informazione circa l'integrità di RNA. Il Bioanalyzer Agilent è una piattaforma basata su microfluidica per il dimensionamento, la quantificazione e il controllo della qualità del DNA, RNA, proteine ​​e cellule, e utilizza una metrica integrità RNA conosciuta come numero di integrità dell'RNA (RIN) ^8. RNA estratto con questo protocollo produce 260/280 rapporti che vanno dal 1,7-2,0 e valori RIN ≥ 7.0. Un esempio di analisi Agilent Bioanalyzer dell'RNA batterico recuperato da questo protocollo è illustrato nella figura 1.

Figura 1. Agilent Bioanalyzer elettroferogramma e gel-come immagine di Pseudomonas aeruginosa totale del campione di RNA isolati e recuperati da topo contenuti del cieco. RIN 8.0.

Discussione

Il metodo di estrazione di RNA qui descritto consente il recupero di una quantità sufficiente di alta qualità RNA totale Pseudomonas aeruginosa raccolte dal tratto GI murino. Questo metodo non si limita a P. aeruginosa e possono potenzialmente essere applicato ad altri batteri. Il recupero di organismi microbici sufficiente da parte dell'intestino varia significativamente da un organismo all'altro. Nel nostro modello murino, P. aeruginosa tipicamente colonizza il tratto gastrointestinale murino a livelli tra 5 x 10 ⁷ a 5 x 10 ⁸ CFU / g feci ^4. Dal momento che il contenuto recuperato del cieco sono circa 0,5 grammi, il numero stimato di P. aeruginosa recuperato da due cecums è compresa tra 5 x 10 ⁷ a 5 x 10 ⁸ cfu. Se altri microrganismi vengono utilizzati, sarebbe prudente per verificare i livelli di colonizzazione GI e quindi calcolare il numero di cecums necessari per recuperare il numero mirato di cfu. E 'anche importante notare che quando si utilizza questo particolare modello murino, topi trattati con antibiotico non infettati con PA non quantificabile quantità di RNA isolati dal loro contenuto cecale.

Il nostro modello murino di colonizzazione Pseudomonas aeruginosa gastrointestinale e tentativi di diffusione di emulare la patogenesi di P. aeruginosa batteriemia nel cancro e pazienti sottoposti a trapianto di cellule staminali. In questa popolazione di pazienti, la flora commensale è spesso impoverito secondaria al trattamento con antibiotici o chemioterapici (ad esempio l'esaurimento antibiotico di GI flora commensale) con conseguente proliferazione di microbi patogeni (ad esempio mono-associazione con P. aeruginosa) e successiva diffusione, dopo la soppressione immunitaria. I vantaggi ei limiti di questo modello murino sono già stati affrontati in precedenza ^4. Lo scopo di questo studio è di fornire una metodologia per isolare microbica RNA totale dal tratto GI. Questo protocollo può essere facilmente adattato ad altri modelli murini che lo studio di altri aspetti della patogenesi microbica nel tratto gastrointestinale (per esempio la flora commensale interazioni, effetti batterica sulle malattie infiammatorie intestinali, ecc.)

Un vantaggio di questo metodo è l'incorporazione di passi lisi multiple compreso gelo / disgelo, distruzione meccanica (polverizzando con malta / pestello, omogeneizzazione), bollitura, e lisi chimica (per esempio, SDS). Nonostante la moltitudine di passi lisi, alcuni microrganismi (in particolare batteri Gram-positivi e funghi / lievito) possono richiedere ulteriori rottura meccanica. Dopo il caldo lisi / acido fenolo-cloroformio incubazione (Step 3.5), l'aggiunta di perline (0,1 mm per i batteri e / o di 0,5-0,7 mm per lievito) e una successiva perline battendo passo dovrebbe essere sufficiente per lisare questi organismi ^{9, 10.}

Data la natura complessa del materiale recuperato dal topo cieco, le ripetute freddo estrazioni acid-phenol/chloroform (Passo 3,7-3,9) sono assolutamente necessari per ottenere qualità accettabile RNA e l'integrità per ulteriori reazioni a valle. Tra i 3-5 freddo estrazioni acid-phenol/chloroform può essere richiesto prima che l'interfaccia bianca tra le fasi acquosa e organica è eliminata. Infine, la combinazione di entrambi i trattamenti DNasi (punto 4) e il protocollo di pulizia RNeasy (Fase 5) sono essenziali per la rimozione del DNA contaminante e piccoli non-mRNA (5s e tRNA). Come affermato in precedenza, l'RNA recuperato utilizzando questo protocollo è di quantità e qualità sufficienti per il profiling di trascrizione successivi ^3, qPCR (inedito), e RNA Seq (inedito) esperimenti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
Mortaio e pestello	Pescatore	12-947-1
Omogeneizzatore	Omni	TM-125
Oak Ridge provette (50 ml)	Nalgene	3119-0050
Acido fenolo / cloroformio	Ambion	AM9720
Cloroformio	Sigma-Aldrich	C2432
L'alcol isoamilico	Sigma-Aldrich	W205702
Isopropanolo	Sigma-Aldrich	190764
Dietil pirocarbonato (DEPC)	Sigma-Aldrich	40718
DNasi	Ambion	AM2238
RNeasy Kit	Qiagen	74104
3M sodio acetato	Ambion	AM9740
100% di etanolo	Sigma-Aldrich	E7023