Costruzione di un laser a basso costo del sistema assotomia per studiare la rigenerazione assonale nel C. elegans</em

Sommario

Laser assotomia seguito da time-lapse imaging è un modo sensibile al test gli effetti delle mutazioni in C. elegans Sulla rigenerazione degli assoni. Una qualità elevata, ma economico, sistema di ablazione laser possono essere facilmente aggiunti alla maggior parte dei microscopi. Passa il tempo di imaging più di 15 ore richiede un'attenta immobilizzazione del worm.

Abstract

Laser assotomia seguito da time-lapse microscopia è un test sensibile per fenotipi la rigenerazione degli assoni in C. elegans ^1. La difficoltà principale di questo saggio è il costo percepito ($ 25-100K) e tecniche necessarie per implementare un sistema di ablazione laser ^2,3. Tuttavia, laser a stato solido a impulsi dei costi modesti (<$ 10K) in grado di fornire prestazioni elevate per l'ablazione laser in preparati trasparenti in cui gli assoni di destinazione sono "vicini" alla superficie del tessuto. Costruzione e l'allineamento di un sistema può essere compiuto in un giorno. Il percorso ottico fornito dalla luce del condensatore focalizzato alla ablazione laser fornisce una comoda guida di allineamento. Un modulo intermedio con tutte le ottiche rimossa può essere dedicata alla ablazione laser e assicura che non gli elementi ottici devono essere spostati durante una sessione di ablazione laser. Un dicroico nel modulo intermedio permette l'imaging simultaneo e ablazione laser. Centrando il raggio laser to il raggio uscente dalla lente focalizzata condensatore microscopio guida l'allineamento iniziale del sistema. Una varietà di lenti utilizzata per il condizionamento ed espandere il raggio laser a riempire l'apertura posteriore della lente dell'obiettivo scelto. Allineamento finale e la prova viene eseguita con un fronte bersaglio superficie del vetrino di vetro specchiato. Potenza del laser è adeguato per dare un minimo posto ablazione dimensioni (<1um). Lo spot è centrato ablazione con regolazioni di precisione dello specchio ultimi cinematicamente montato di una croce fissa nella finestra di imaging. Laser di potenza per assotomia sarà di circa 10 volte superiore a quello necessario per il primo posto ablazione minima sulla diapositiva di destinazione (questo può variare con l'obiettivo di utilizzare). I worm possono essere immobilizzato per laser assotomia e time-lapse imaging montaggio su cuscinetti agarosio (o in camere di microfluidica ^4). Pastiglie di agarosio sono fatti facilmente con il 10% di agarosio in soluzione salina bilanciata fuso in un forno a microonde. Una goccia di agarosio fuso viene posto su un vetrino e appiattito con un altrovetrino in un trampolino di circa 200 um di spessore (un singolo strato di nastro tempo scorre adiacente viene utilizzato come distanziatore). Un berretto "Sharpie" è usato per tagliare un pad circolare uniforme diametro di 13mm. Anestetico (1UL muscimolo 20mm) e microsfere (Chris Fang-yen comunicazione personale) (1UL 2,65% polistirolo 0,1 um in acqua) vengono aggiunti al centro del pad seguita da 3-5 vermi orientata in modo che siano coricati su un fianco sinistro. Un coprioggetto di vetro è applicata e poi vaselina viene utilizzato per sigillare il coprioggetto ed evitare l'evaporazione del campione.

Protocollo

1. Costruzione di un sistema di ablazione laser

Indossare occhiali di protezione laser e usare buone pratiche di sicurezza del laser durante l'allineamento iniziale. Non guardare attraverso gli oculari quando il laser è acceso.

1. Disporre i componenti sulla basetta come mostrato in fig. 1 (vedi anche l'esempio ^2). Bolt verso il basso il laser (con una piastra riser se necessario), posta periscopio, e supporta ferrovia sopraelevata.
2. Posizionare il microscopio per allineare con l'asse ferroviario. Allineare con il fascio di luce trasmessa dalla lente condensatore microscopio. Allineare il livello dei binari (usare una livella) e la posizione con un'apertura regolabile o una lente apposta alla guida. L'apertura o l'obiettivo deve essere allineato a entrambe le estremità della guida alla trave condensatore. Jack laboratorio può aiutare con la regolazione in altezza su rotaia.
3. Allineare il Glan-Thompson polarizzatore e semionda piastra al raggio laser. Non è necessario il laser a fare questo allineamento. Il bEAM ha solo bisogno di passare attraverso due senza colpire i bordi. Ruotate il polarizzatore per fornire un orientamento e la posizione comoda per la discarica fascio (fig.1). Potrete ruotare la piastra semionda per regolare potenza del laser. Fissare i componenti alla basetta.
4. Accendere il laser, impostare la frequenza degli impulsi a 100, modalità continua, e ridurre la potenza al minimo utilizzando la semionda piatto. Utilizzare un post-it o carta per lenti per visualizzare il raggio laser.
5. Regolare e fissare gli specchi cinematicamente montati in sequenza dal laser per portare il fascio fino allo specchio che è montato sulla fine della ferrovia sopraelevata. Il raggio laser deve essere allineato all'incirca al centro degli specchi. Gli specchi dovrebbero essere orientati circa 45 gradi rispetto all'asse del fascio laser (fig.1).
6. Grossolanamente regolare lo specchio cinematicamente montato sulla parte superiore del periscopio e sulla fine della ferrovia per allineare il raggio laser verso il centro del fascio di luce trasmessa dal microscopio. Sia il raggio laser e tha trasmesso fascio di luce al microscopio possono essere contemporaneamente visualizzati inserendo la carta nel percorso ottico. Assicurarsi che i filtri ND e aperture nel modulo intermedio sono fuori o completamente aperta.
7. Finemente allineare il raggio laser verso il centro del fascio di luce trasmessa con le regolazioni di precisione sul periscopio superiore e specchi su rotaia. Tenere la carta vicino allo specchio ferroviario e allineare il raggio laser verso il centro del fascio di luce trasmessa con lo specchio in alto periscopio. Tenere la carta vicino al porto microscopio e allineare il raggio laser verso il centro del fascio di luce trasmessa con aggiustamenti specchio la rotaia (fig.2).
8. Posizionare un post-it nel percorso ottico tra la lente condensatore allineati e la torretta obiettivo aperto. Si dovrebbe vedere il fascio di luce trasmessa con il raggio laser più piccolo vicino al centro. Utilizzare la regolazione fine sullo specchio ferroviario al centro il raggio laser. Fissare il microscopio in posizione con fascette.

Passi 10,9-1,12 sono opzionali, ma è facile e utile per valutare l'allineamento e ablazione laser prima di aggiungere le lenti fascio di espansione.

9. Spegnere il laser e coinvolgere l'otturatore meccanico di sicurezza. Ruotare il fuori dicroiche 50% del percorso del raggio. Anche se non la luce laser diretta passerà alla oculari, la luce riflessa può essere molto intenso. Montare la diapositiva di destinazione per l'allineamento di precisione e l'immagine con l'obiettivo di olio 60X. Focus sui graffi sul vetrino. Metti in ND4 e ND8 filtro nel modulo intermedio.
10. Immagine della diapositiva bersaglio con il CLSM, disco rotante, o sistema di telecamere CCD. Ruotare il dicroico 50% nel percorso del laser. Da questo punto, non si dovrebbe mai guardare attraverso oculari mentre l'ablazione laser è acceso. Accendere il laser ablazione e impostare la modalità di trigger, frequenza a 100, e il numero di impulsi a 10. Assicurarsi che l'alimentazione è ancora impostato al minimo con la semionda piastra e quindi aprire l'otturatore meccanico di sicurezza. Potete simultaneouimmagine sorniona e utilizzare il laser ablazione.
11. Mentre immagini la diapositiva di destinazione, attivare l'ablazione laser. Controllare la diapositiva di destinazione per un um posto ablazione 1-10 di diametro. Sequenzialmente rimuovere i filtri ND fino a un punto ablazione è visto. Regolare il punto ablazione al centro dell'immagine con lo specchio ferroviario. Si vuole aggiungere indietro di un filtro ND per avere spazio per aumentare la potenza del laser finemente con la mezza lunghezza d'onda piastra per dare un <1 posto ablazione um. Immagine a 0,2 um / pixel o meno e regolare con precisione il luogo ablazione al centro dell'immagine (posizione con 256.256 512x512 immagine).
12. Controllare la profondità di campo e asse del fascio laser. Attenzione su e giù per 1-2 um e controllare la posizione e dimensione dello spot ablazione ablazione. Se il raggio laser viene allineato assialmente posto ablazione non si muove. Il raggio laser incondizionato distribuirà il potere su um diverse (circa 3-5 um da cima a fondo di messa a fuoco).

2. Aggiungi lenti per ampliare il raggio laser per riempire il retro obiettivoapertura e regolare la convergenza di controllo del fuoco

1. Questo sistema utilizza due raggi galileo espansori per espandere il raggio laser per riempire l'apertura posteriore dell'obiettivo (10 mm). Montare il 4 lenti a vettori e allegarli alla guida (+ L1f1 L2f2 e L3f1 '+ L4f2'). Regolare le posizioni in modo che tutti gli obiettivi sono alla stesso asse ottico ed esattamente ortogonale al fascio laser (fig. 2).
2. Accendere il laser e adeguarlo alla potenza minima e modalità continua. Circa regolare l'allineamento del fascio attraverso ogni lente utilizzando la carta per vedere il raggio laser e fascio di luce trasmessa dal condensatore microscopio. Spegnere e scatto il laser.
3. Rimuovere le fascette da un lato del microscopio e il microscopio scivolare fuori dal percorso del raggio laser. Accendere il laser e rimuovere otturatore di sicurezza.
4. L'allineamento di precisione delle lenti e il raggio laser può essere eseguita visualizzando il fascio laser espanso su un muro vicino. Il raggio dovrebbe espandono e si contraggono simmetricamente quando il lens vengono spostati. Regolare gli ultimi due specchi cinematicamente montato per allineare il fascio (fig.3).
5. Il profilo del fascio allineato ed espanso dovrebbe essere circolare e di luminosità uniforme (fig.3). Le dimensioni e l'uniformità del fascio può essere visualizzato con un post-it nella posizione stimata dell'apertura posteriore obiettivo.
6. Il raggio deve essere regolato a zero di convergenza per l'infinito sistemi ottici. La convergenza può essere stimata notando come cambia dimensioni del fascio, come si sposta un post-it più lontano dalle lenti. Spegnere il laser e coinvolgere l'otturatore meccanico.
7. Far scorrere il microscopio indietro nel percorso del raggio laser utilizzando le pinze fisse a definire il corretto allineamento. Sostituire i morsetti sul lato libero del microscopio, ma non stringere verso il basso.
8. Accendere il laser e rimuovere l'otturatore di sicurezza. Ruotare la torretta obiettivo di una posizione aperta. Posizionare un post-it sul palco. Si dovrebbe vedere il raggio laser estesa e uniforme incentrata sul b luce trasmessaEAM dal condensatore (fig.4). Potrebbe essere necessario centrarlo allentando i morsetti microscopio e con attenzione dando una gomitata al microscopio.
9. Coinvolgere l'otturatore di sicurezza, e impostare il laser per attivare la modalità. Ruotare l'obiettivo 60X in posizione e l'immagine graffi superficiali sulla diapositiva di destinazione.
10. Rimuovere l'otturatore di sicurezza, attivare il laser ablazione e regolare la potenza del laser per il primo posto ablazione minima. Lo spot ablazione deve essere circolare e all'interno um 10/05 del centro dell'immagine.
11. Centro il punto ablazione con regolazioni di precisione di guida cinematicamente specchio montato. Avrete bisogno di aggiustare iterativamente le montato su rotaia e specchio periscopio verso il centro sia il luogo ablazione e mantenere un profilo uniforme fascio.
12. Valutare il focus Z del laser spostando il focus sistematicamente su e giù in passi da 1 um e innescando il laser ablazione. Il raggio ampliato, allineata e di convergenza dovrebbero regolare l'ablazione al massimo alla messa a fuoco dell'immagine e debolmente o per niente 1 um abOve o al di sotto messa a fuoco (fig. 5).
13. Regolare il fuoco Z del fascio ampliato spostando lente L3 del cannocchiale galileiano (fig.2).

3. Assotomia laser e microscopia time-lapse di rigenerazione degli assoni

1. Forno a microonde 10% agarosio (RPI Biologia Molecolare Grado EEO 0,1 A20090) in soluzione salina bilanciata fino completamente fuso. Situato su una piastra calda per tenerlo fuso durante l'uso per il montaggio.
2. Una goccia di agarosio fuso viene posto su un vetrino e appiattito con un altro vetrino in un pad (viene utilizzato un unico strato di nastro tempo scorre adiacente come distanziatore) circa 200 um di spessore.
3. Un berretto "Sharpie" marcatore è usato per tagliare un pad circolare uniforme diametro di 13mm.
4. Anestetico (1UL muscimolo 20mm) e microsfere (Chris Fang-yen, comunicazione personale) (2,65 1UL polistirolo% 0,1 um in acqua) vengono aggiunti al centro del pad seguita da 3-5 vermi orientata in modo che siano coricati su un fianco sinistro . Un coprioggetto di vetro viene applicato e poi Vaseline viene utilizzato per sigillare il coprioggetto ed evitare l'evaporazione del campione (fig. 6).
5. L'ablazione laser è allineato a croce, come descritto in precedenza, all'inizio di ogni sessione. Coinvolgere l'otturatore di sicurezza laser.
6. Rimuovere l'obiettivo di allineamento laser e l'immagine di un verme adulto montato con un marcatore fluorescente adatto nei neuroni bersaglio. Assoni immagine con un ingrandimento simile (0,2 um / pixel o superiore ingrandimento) e la posizione sotto la croce (fig. 7).
7. Aprire l'otturatore di sicurezza laser e attivare l'ablazione laser mentre imaging. Valutare l'assone dopo l'attivazione del laser e lentamente aumentare la potenza laser fino a quando l'assone viene tagliato. Avrete bisogno di circa 10 volte più potenza del laser per tagliare gli assoni che per formare un punto di ablazione della diapositiva obiettivo di allineamento (circa 1uJ / ns a impulsi). Noi di solito tagliato con 100 impulsi a 2,5 kHz e potenza insieme a circa 0.27mW (potenza media misurata a campione con Coherent misuratore di potenza FieldMaxII e laser impostato su continuo a 2500 Hz). L'ablazioneimpostazione della potenza laser sarà coerente per il taglio di assoni in esperimenti futuri (fig.7).
8. Un assone con successo taglio mostrerà una pausa di circa 0,5-1 um senza perdita di luminosità nelle due estremità tagliate (fig. 7). Una grande perdita di luminosità e un ampio divario (2-10 um) significa spesso ingenti danni al di là del assone da una bolla di cavitazione. Gli assoni prossimali e distali separerà e forma lampadine retrazione per i prossimi 30 minuti (fig. 8 e filmato).
9. Equilibrare il tuo worm montato con quello scelto microscopio per 30 minuti prima di iniziare la registrazione lasso di tempo. Questo ridurrà al minimo deriva a causa di differenze di temperatura e la contrazione agarosio.
10. ) Time-lapse parametri di imaging vengono impostati tramite il software di imaging associati con il sistema. Noi di solito l'immagine 10-20 punti Z (1um/step) a 0,1-0,2 um / pixel utilizzando guadagno, foro stenopeico, velocità di scansione e imaging impostazioni di potenza del laser che riducono al minimo l'esposizione dando la risoluzione desiderata spaziale. Intervalli di campionamento sono tipiciLy 1-5 minuti oltre 15 ore a seconda della risoluzione desiderata temporale (fig. 8 e filmato).
11. Time-lapse dati delle immagini sono convertite in film usando elementi NIS o ImageJ.

4. Rappresentante dei risultati:

Laser assotomia utilizzando questo sistema è un affidabile e di routine. I risultati mostrati in figura 7 sono tipici. Time-lapse imaging di rigenerazione assonale è molto robusto con questo protocollo. Noi abitualmente taglio e l'immagine fino a 5 assoni in 5 vermi diversi su una singola diapositiva utilizzando uno stadio motorizzato. L'unica limitazione è il tempo necessario per raccogliere le immagini di ogni assone, ad esempio, se ci vogliono 20 secondi per raccogliere una pila di un assone poi al massimo si può gustare 9 assoni (9 pile) se siete di campionamento ogni 180 secondi. L'esempio mostrato nelle figure 8 e 9 è un buon risultato rappresentativo. Circa il 10% degli esperimenti danno risultati di questa qualità. Gli esperimenti rimanenti forniscono dati utili sul fenotipo rigenerazione, ma sono esteticamente unappealzione a causa di piccoli movimenti jittering del worm che in genere iniziano dopo 5-8 ore di immobilizzazione.

Figura 1 Sistema di ablazione laser. I 532 nm Nd: Yag laser è montato su una piastra riser per portarlo all'altezza degli altri componenti e imbullonato al basetta. (Isolatore ottico è opzionale e probabilmente non necessario). La Glan-Thompson polarizzatore e semionda piastra vengono utilizzati per controllare con precisione la potenza del laser. Sono in monta rotazione finemente calibrato. Fate attenzione impostazione della discarica fascio. Lo specchio d'angolo indirizza il raggio laser verso lo specchio periscopio inferiore. Lo specchio periscopio superiore indirizza il raggio verso lo specchio ferroviario. La guida è montato su due piattaforme supportate asta. Doppio lenti Galileo sono attaccati ai monti rotaia di scorrimento. Notate il modulo aggiunto intermedio dedicato alla ablazione laser. Il sistema potrebbe essere reso più compatto, eliminando le ottiche isolatore e lo specchio d'angolo, e il riposizionamento del laser, Glan-Thompson polarizzatore e semionda piatto al bordo posteriore della basetta.

Figura 2 lenti a doppio condizionata galileiani sono utilizzati per espandere le 300 um TEMoo raggio laser per uno zero dimensione uniforme convergenza millimetri 10. Una presa di laboratorio si trova sotto una delle piattaforme tenendo la ferrovia. Questo aiuta a regolare l'altezza ferroviario durante le fasi di allineamento. Crudamente regolare l'altezza di guida montando la lente L1 alla guida e utilizzare il fascio condensatore come una guida di allineamento. Regolare la guida in modo che il fascio condensatore si allinea con il centro della lente ad entrambe le estremità della guida. Questo garantisce che il binario è allineato parallelamente all'asse ottico del microscopio. Potrebbe essere necessario regolare prima il microscopio per abbinare l'asse ottico della guida. Utilizzare fascette per fissare la posizione del microscopio (vedi fig. 1). Rimuovere °e rotaie lente. Ora allineare il raggio laser al centro del fascio condensatore ad entrambe le estremità della guida. Un documento nel percorso ottico è un modo conveniente di vedere entrambi i fasci contemporaneamente. Utilizzare lo specchio in alto periscopio per allineare il raggio laser il fascio condensatore vicino alla rotaie specchio. Utilizzare la rotaia specchio per allineare il raggio laser al raggio condensatore in fondo del binario (più vicino al microscopio). Ora montare tutte le quattro lenti alla guida, come mostrato in figura. La lunghezza della guida, la lunghezza focale degli obiettivi, nonché le modalità lente varia a seconda del microscopio e set up fisico. Parametri critici sono il diametro del raggio laser e le dimensioni dell'apertura posteriore dell'obiettivo prescelto. Infinity sistemi ottici si concentrerà perfettamente parallelo raggio laser (zero convergenza). Distanza tra L1 e L2 dovrebbe essere somma delle lunghezze focali delle lenti, f1 + f2, e la distanza tra L3 e L4 dovrebbe di conseguenza essere f1 '+ f2'. La distanza tra °e le coppie a doppio Galilea non è critica. Posizione di L3 può essere finemente regolato per controllare la convergenza del fascio; <1 millimetro aggiustamenti saranno necessari per regolare il fuoco del laser per la messa a fuoco dell'immagine. Accertarsi di rimuovere tutti gli obiettivi, filtri, aperture, ecc dal modulo intermedio che potrebbe essere nel percorso ottico (o essere consapevoli di ciò che fanno e regolare il sistema di conseguenza).

Figura 3 allineamento del fascio laser attraverso le lenti dual Galileo. Rimuovere le fascette microscopio da un lato del microscopio in modo che il microscopio può essere spostato fuori del percorso del fascio, ma i morsetti rimanenti permetterà al microscopio in modo preciso riposizionamento. Pensate di sicurezza laser. Assicurarsi che la potenza del laser viene regolata al minimo con il polarizzatore Glan-Thompson. Accendere il laser e visualizzare il fascio laser sul muro. È possibile trovare una carta attaccata al muro aiuta a visualizzare il laserspot. Sistematicamente regolare le posizioni delle lenti per avere un'idea di quello che fanno alla dimensione del fascio e l'aspetto. Si dovrebbe vedere qualcosa che assomiglia a pannello A, dove uno spot intenso è eccentricamente situato in un profilo dimmer. Utilizzare il rotaie specchio per regolare il punto forte per il centro, come mostrato nel pannello B. Ora usate il periscopio per montaggio di specchio per dare un profilo uniforme periferico. Se tutto è allineato correttamente, si dovrebbe ora trovare le lenti che in movimento fa sì che il fascio di espandersi e contrarsi in modo simmetrico. Spostare indietro le lenti le posizioni di partenza, come mostrato in figura 2. Ora intercettare il fascio alla distanza dell'apertura posteriore obiettivo. Si deve essere circolare, almeno abbastanza grande da riempire la vostra apertura posteriore e di una luminosità uniforme. E 'OK se è più grande, finché si dispone di sufficiente potenza laser per il tuo ablazioni. Valutare la convergenza confrontando diametro del raggio alla distanza dell'apertura posteriore dell'obiettivo e il muro. Diametro del fascio deveessere identico per un raggio di convergenza a zero. Barra di scala è di 10 mm.

Figura 4 Allineamento del fascio laser espanso per il fascio condensatore. Shutter il laser e spostare il microscopio di nuovo nel percorso del fascio laser utilizzando le fascette come si ferma l'allineamento. Accendere, allineare e mettere a fuoco il fascio condensatore utilizzando un obiettivo lente. Nastro di carta negli oculari per impedire a chiunque di visualizzare l'intensa luce laser riflessa. Ruotare la torretta obiettivo di una posizione aperta. Mettete un pezzo di carta sul palco per occludere il fascio condensatore. Accendere il laser al modo continuo e rimuovere l'otturatore meccanico di sicurezza. Si dovrebbe vedere qualche luce laser provenienti anche se il microscopio. Allentare le fascette microscopio e spingere delicatamente il microscopio per allineare il raggio laser con il fascio condensatore. Il raggio laser deve essere circolare e di luminosità uniforme. A volte è utile adju° il rotaie lenti. Dovreste essere in grado di espandersi e contrarsi il raggio laser in modo uniforme se l'allineamento sia corretto. Si può centrare il raggio laser contratto al raggio minimo condensatore centrato con il rotaie specchio e poi espanderlo alla dimensione desiderata. Una volta regolare la posizione del fascio di contratto con lo specchio ferroviario, è necessario regolare lo specchio in alto periscopio montato a mantenere una luminosità uniforme del fascio allargato. Se non è possibile ottenere un raggio laser circolare centrata allora si avrà bisogno di tornare indietro attraverso le fasi di allineamento prima.

Figura 5 Centro posto ablazione e regolare la convergenza raggio laser per la messa a fuoco ottimale. Spegnere e scatto il laser. Rimuovere la carta e montare il vetrino obiettivo di mirroring (potete anche usare inchiostro permanente marcatori su un vetrino come obiettivo ^2). Immagine graffi sulla superficie a specchio con il 60X lente olio 1.4na) Ora l'immagine della superficie con un confocale o CCD. Non guardare attraverso gli oculari mentre il laser è acceso. Accendere e unshutter il laser. Impostare il laser per attivare la modalità, la più bassa potenza, e 100 Hz. Trigger circa 10 impulsi. Si dovrebbe vedere uno spot ablazione di 1-5 um di diametro entro 10 um del centro di vista. Se non vedi un posto ablazione è possibile aumentare la potenza del laser in passi 5-10%. Una volta identificato un luogo ablazione, centro al campo di vista. Mettere il mirino a 256, 256 se coordinate visualizzazione delle immagini 512x512. Se si regola il punto laser al centro, allora non cambierà posizione con lo zoom. Utilizzare la rotaia specchio per spostare il punto di ablazione per il mirino centro. Rivalutare l'uniformità del fascio laser guardando il fascio con l'obiettivo rimosso come descritto nella Figura 4. Regolare l'uniformità del fascio con lo specchio per montaggio di periscopio. Ripetere la valutazione della posizione a pronti ablazione. Questo è un iterativo pPROCESSO che dovrebbe essere ripetuto fino a quando l'ablazione è posto al centro e il raggio ampliato è uniforme. Se fatto correttamente il luogo ablazione sarà circolare, come si è visto nel punto ablazione a fuoco in figura. Avanti valutare la messa a fuoco del raggio laser lungo l'asse Z. Attivare il laser per produrre uno spot ablazione di circa 1 um al centro. Ora spostare la diapositiva circa 5 um lateralmente e concentrarsi 1 um di sotto della superficie del vetrino di destinazione. Innescare il laser utilizzando le impostazioni laser stesso utilizzato per il primo posto ablazione. Ripeti dopo di messa a fuoco 1 um sopra la superficie del vetrino di destinazione. Se il raggio laser viene focalizzato alla messa a fuoco dell'immagine allora si dovrebbe vedere uno schema simile a quello mostrato in questa figura. Lo spot più grande ablazione dovrebbe corrispondere alla messa a fuoco dell'immagine e le macchie ablazione sopra e sotto ci si dovrebbe concentrare diventano più piccoli simmetricamente. Regolare lente L3 per allineare piani focali. Spostamento lente L3 lontano dal microscopio farà il raggio più convergenti e il luogo ablazione si sposta più vicino allal'obiettivo. Piccola <1 millimetro aggiustamenti saranno necessari nei pressi fuoco. Ora siete pronti a tagliare gli assoni. Barra di scala è 1 um.

Figura 6 vermi di montaggio per assotomia laser e time-lapse imaging. Agarosio 10% in soluzione salina viene riscaldata fino a completamente fuso. Una piccola goccia è posto su un vetrino per microscopio e poi schiacciata con un altro scivolo per formare un pad piatto. Lo spessore del pad è stabilito dal nastro su due colonne adiacenti. Il pad è permesso di impostare per circa 1 minuto e poi le diapositive sono separati. Una top "Sharpie" è usato come uno stampo per formare un blocco omogeneo di dimensioni di circa 13 mm. 1 ul di 10mm muscimolo e 1 ul di microsfere vengono aggiunti al centro del pad (Fang-yen comunicazione personale). I worm sono aggiunti al calo del 2 ul e orientata prima di mettere sul coprioggetti di vetro. Vaselina viene poi applicata da una siringa (20-25 cal. Ago) a bordo del coprioggetto per sigillarla.

Figura 7 risultati tipici di laser assotomia in C. elegans. In A è possibile vedere l'assone intatto poco prima e dopo il laser assotomia. Il divario è normalmente circa 0,5-1um. B mostra laser assotomia di un assone senza danneggiare un assone vicino circa 1 um distanza. Laser è stato impostato a circa il 10% della potenza (0,3 media mW a 2500 Hz), e 100 impulsi. Barra di scala è di 5 um.

Figura 8. Tipico wild-type L4 rigenerazione. Si tratta di una serie temporale che mostra l'ablazione e time-lapse di rigenerazione degli assoni. Poco dopo laser assotomia a 0 minuti si può vedere la lampadina ritrattazione. Da 138 minuti la lampadina ritrattazione è tirato indietro alla sua estensione più lontana e ora cominciato a rimodellare. Sporgenze membrana sporadici (mircospikes o filopodia) possono essere visti lungo l'asta assone (frecce 138 e 324). Ilceppo diritto si estende ben formata cono compatto crescita a 360 minuti. A 414 minuti sia i ceppi hanno esteso coni di crescita. La prima embrionale-come coni di crescita diventare distrofico come si estendono verso il cordone nervoso dorsale (414, 519 e 597 minuti). Il distrofiche crescita coni stallo corta del cordone nervoso dorsale (960 minuti). Punte di freccia sottolineare moncone prossimale e coni di crescita. Le frecce indicano le sporgenze membrana lungo l'asta assone prossimale. Scala grafica 20um.

Movie 1. Filmato di rigenerazione degli assoni tipo selvatico. Questo film va di pari passo con i punti temporale della Figura 8. I worm sono stati montati come descritto nel protocollo e assoni erano ripreso ogni tre minuti per circa 10 ore. Z stack (20 X 1um) sono state prese in ogni fase e fusi in singole immagini da un algoritmo di proiezione massima (Elementi NIS). Clicca qui per guardare il film.

Discussione

Ci sono diverse discussioni in buona laser microchirurgia con sistemi laser diversi ^3,5-11. I laser a femtosecondi IR sono il "gold standard" per l'ablazione laser subcellulare ¹² e conveniente se associato ad un impianto di imaging, ma spesso sono troppo costosi per i singoli utenti. Se avete bisogno di un laser a femtosecondi per l'imaging IR il campione a causa della profondità delle immagini allora si avrà probabilmente bisogno di un laser per assotomia. Tessuti trasparenti con assoni target entro 30-50 um della superficie sono probabilmente fattibile con impulsi laser blu e verde nel UJ / impulso 20 target range attraverso una lente ad alta immersione na. Ci saranno danni collaterali di più con il laser nano e pico secondi rispetto al laser a femtosecondi, tanto più che la profondità aumenta assone il bersaglio. C. elegans è trasparente e tutti gli assoni sono entro 20-30 um della superficie. Noi abitualmente taglio assoni motori che si trovano entro 5 um della superficie. Abbiamo anche facilmente tagliare asciaons all'interno dell'anello nervose che sono circa 20 um dalla superficie della cuticola. Abbiamo trovato il limite per il taglio di assoni di essere di circa 30-50 um attraverso il diametro di un verme adulto. E 'probabile che il sistema di ablazione laser qui descritto dovrebbe funzionare bene con molti preparazioni diverse che soddisfano i criteri di trasparenza e la profondità degli assoni di destinazione. Eppure, è un po 'sorprendente, dato il vantaggio teorico del laser a femtosecondi IR, che 355 nm nano e picosecondo e 532 nm laser svolgere così bene per laser assotomia in C. elegans ^6,13. Non vediamo differenze nella rigenerazione degli assoni in risposta al laser assotomia con nanosecondo 440 nm, 532 nm nanosecondo, infrarossi e laser a femtosecondi.

Stato solido 355 nm laser UV sono circa lo stesso costo della 532 nm diodo pompato passivamente Q-Switched laser a stato solido, ma richiedono potenze superiori o ottiche che passano in modo efficiente queste lunghezze d'onda più corta. La maggior parte delle ottiche sono progettati per eseguire ben visibile con 400 -700 nm di luce. 355 nm laser offrirebbe alcuni vantaggi ⁶ come soglia plasmatiche ridotte, dimensione dello spot più piccoli, e un dicroico passaggio lungo in modo efficiente diretta del 100% del laser ablazione al target e permettere l'imaging simultaneo di GFP senza perdita di segnale campione. I laser blu 440 nm avrebbe mantenuto i vantaggi di lavorare con un laser a luce visibile (buone prestazioni con ottica standard e di sicurezza). Purtroppo, il costo di un DPP Q-switched a stato solido 440 nm laser è 3 volte il costo di un laser 355nm o 532 nm di potenza simile in questo momento. Se dovessimo progettare un nuovo sistema per la C. elegans, dove la profondità obiettivo è minimo, dovremmo optare per una lente trasparente UV (costo circa $ 3.000 per una lente 40X olio 1.3na con 50-70% di trasmittanza a 355nm) e un laser a 355 nm, la produzione di 5-10 UJ / impulso a 1 -20 kHz.

Ablazione assone è pensato per essere causa di formazione di plasma. Impulsi più brevi produrrà soglie di plasma a bassa potenza e il volume del plasma w malati più piccolo ^6. L'obiettivo è quello di produrre il plasma più piccolo e più breve durata, regolando l'energia dell'impulso al minimo potere. Grandi longevi plasma genera bolle di cavitazione che danneggiano le cellule circostanti. Abbiamo trovato generalmente che l'ablazione con circa 50-100 impulsi a frequenza più alta (cioè 2,5 kHz) dà i migliori risultati. Ciò suggerisce che il danno può essere gradualmente integrati su una serie di impulsi per controllare meglio l'entità del danno. Il sistema di ablazione laser qui descritto è molto indulgente se il fascio è allineato ed espanso con precisione. Partiamo taglio assoni in vermi adulti in potenza del laser del 10% (media di 0,3 mW misurata a 2500 Hz e circa 1 UJ / impulsi) e può tagliare con danni limitati localizzato a 14% di potenza. È possibile osservare grandi aree di danno 15-39% della potenza laser, ma solo al di sopra del 40% di potenza (circa 1 mW media misurata a 2500 Hz) fare i vermi esplodere a causa di bolle di cavitazione e grandi danni al cuticola del worm.

e_content "> I et al. 2010 ² carta è una risorsa eccellente per la costruzione di un sistema di ablazione laser. Steinmeyer Leon Avery ha anche una bella descrizione pratica di un sistema di ablazione laser basato su un laser a gas poco costoso nm N2 337 e si fornisce alcuni pratici grande consulenza (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). Nel progettare il vostro sistema si deve prima parlare con il rappresentante microscopio per determinare come obiettivo l'ablazione laser per l'obiettivo microscopio. Il microscopio deve essere montato su un tavolo isolamento delle vibrazioni (Newport, TMI, Thor). Una parte superiore basetta è ottimale, ma un piano in acciaio solido può ancora essere utilizzato con posizionatori magnetico. Un modulo dedicato intermedio in un ambito in piedi è bello perché tutti gli elementi ottici possono essere lasciati sul posto. Tuttavia, può essere meno costoso e più conveniente per utilizzare una porta macchina fotografica (invertito) o un "combinatore" allegato a un epi-fluorescenza porta. È necessario conoscere la dimensione della apertura posteriore e la trasmissione (a uno blation laser a lunghezza d'onda) della lente obiettivo che si intende utilizzare. Una volta che si decide su un laser (per esempio, Crylas, TEEM, Crystal, o CRC) è necessario contattare Thor o Newport per aiutare con la selezione degli elementi giusta ottica, le attrezzature hardware e sicurezza. Abbiamo deciso su un expander doppio trave Galileo per risparmiare spazio, ma una semplice espansione kepleriana è un'opzione (f2/f1 = fattore di espansione). Un expander fascio personalizzato sarà il meno costoso, ma Newport, Thor, e molti dei produttori di laser offrono ottime qualità commerciale del fascio espansori. Alcuni produttori offrono anche attenuatori laser manuale e controllata elettronicamente, che può essere conveniente e risparmiare spazio, ma non è versatile come il polarizzatore Glan-Thompson e onda piastra metà. Sarà inoltre necessario decidere come controllare il laser. È possibile progettare un controller basato LabView, utilizzare un generatore commerciale TTL, o software forniti dalla società laser. Discutere le opzioni con il produttore laser specifici.

tenda "> Abbiamo fornito un elenco dell'hardware che abbiamo utilizzato solo come guida generale. Il sistema descritto qui costano circa $ 15.000 quando aggiunto al nostro sistema di imaging esistente. Il dipartimento di Fisica locali hanno spesso qualcuno disposto a fornire un'introduzione pratica alla tranquillamente lavorare con i laser a fascio libero.

Metodi alternativi per l'immobilizzazione e il tempo lapse imaging di C. elegans sono state recentemente descritte ^14.

Risoluzione dei problemi

Il passo più difficile e critica è l'allineamento del fascio centrato ampliato rispetto all'asse ottico del microscopio. Una volta che hai centrato il raggio e ampliato attraverso le lenti Galileo si deve lavorare sodo per farlo allineati entro 5 um di asse ottico del microscopio PRIMA di usare gli specchi guida per l'allineamento finale al centro. L'uso eccessivo degli specchi dello sterzo per allineare il fascio al microscopio lo spostamento fuori asse attraverso il fascioespansione. UTILIZZARE ESTREMA CAUTELA è possibile attenuare il fascio laser con il filtro ND appropriato e visualizzare direttamente il profilo del fascio laser su un bersaglio riflettente (specchio superficie frontale). Si può spingere delicatamente il microscopio per centrare il proprio raggio nel campo dell'obiettivo 60X di vista (se non può essere centrato in alto / basso gamma è necessario regolare l'altezza della ferrovia). Il profilo del fascio può essere usato per allineare con precisione l'asse ottico microscopio per dare un raggio centrata che è circolare e di "razzi" simmetricamente. Un bagliore asimmetrico è un'indicazione che l'asse microscopio non è perfettamente allineato (o la ferrovia non è in piano). Infine, è necessario regolare L3 e constatare uno sviluppo uniforme e simmetrica e la contrazione del raggio. Messa a fuoco il microscopio proprio sulla superficie di destinazione e quindi regolare L3 mettere a fuoco il raggio laser per la più piccola macchia. Si dovrebbe ora trovare il raggio laser che si trova a 5 um del centro quando immaginato attraverso LSCM o CCD sistema e il punto è all'interno di ablazione1um di messa a fuoco Z.

Se si trova si sta "esplodere" vermi o costantemente generando bolle di cavitazione grande per tagliare assoni il tuo problema è molto probabilmente l'allineamento di precisione del laser ablazione. Assicurarsi che il minimo (<500 nm) posto ablazione è localizzata al centro Z (regolare la convergenza con lente L3) e al posto XY fiduciario (regolare con l'ultimo specchio cinematicamente montato).

Targeting assoni più vicino alla superficie richiedono meno potenza del laser. Allo stesso modo, piccoli animali (L1 e L2) richiedono potenza del laser in meno per assotomia rispetto al targeting degli assoni stessi negli adulti.

Se il vostro assoni wild-type non si rigenerano o la candeggina assoni si dovrebbe provare a ridurre la potenza del laser di imaging o diminuendo la frequenza di campionamento. Se il worm morire o diventare stucchevole provare a ridurre la percentuale di agarosio con incrementi dell'1%. Assicurati di non spostare il coprioggetti dopo vermi di montaggio come questo spesso li inducono a morire quando si utilizzano elevate perpercentuale di agarosio e microsfere.

Se il worm scoppio o morire durante un time-lapse sessione è dovuto a: 1. Percentuale di agarosio è troppo alta. 2. Danni alla cuticola di ablazione laser. 3. Movimento dei coprioggetto dopo il montaggio. Se il danno per la cuticola è la colpa sarà solo sui vermi montati che sono stati colpiti con l'ablazione laser.

Se il verme si muove troppo durante un time-lapse sessione di provare ad aumentare la percentuale di agarosio 0,5% in passi. Assoni sani in vermi sani sono sempre "attivo" e visualizzare un livello coerente di fluorescenza. Se si vede una diminuzione improvvisa della fluorescenza o attività del worm sta morendo o morto. Multiple assoni perline o frammentate sono un segno sicuro di un worm morente o morta.

Se avete difficoltà a mantenere il tuo assoni a fuoco durante l'intera sessione lasso di tempo ci possono essere diversi problemi. Prima controlla la tua deriva palco da un campione di imaging inerte su un vetrino da oltre 10 orers. Una deriva pochi micron può essere dovuto alla instabilità termica, ma superiore a 5 um è probabilmente a causa di problemi meccanici con il microscopio. Problemi con il montaggio sono più comuni. Lasciate che il vostro worm montato equilibrare con quello scelto microscopio per 30 minuti prima di iniziare il lasso di tempo. Verificare che il sigillo vaselina non hanno sviluppato le perdite nel corso della sessione lasso di tempo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
535 nm laser	Crylas	FDSS532Q3	(TEEM, Crystal, e CRC offrono anche laser comparabili)
Tutte le ottiche e l'hardware			(Thor offre ottiche comparabili e hardware)
SUPREMA ottica Monte, 1.0-di diametro	Newport	SS100-F2KN	2
1 "messaggio di diametro, 1" height	Newport	PS-1	1
1 "di diametro della forcella postale	Newport	PS-F	1
Acromatico Zero-Order Wavel Plate, Onda ½ Ritardo, 400-700nm	Newport	10RP52-1	1
Rotazione Stage 1 "Aperature	Newport	RSP-1T	1
1 "messaggio di diametro, 1" height	Newport	PS-1	1
1 "di diametro della forcella postale	Newport	PS-F	1
Glan-Laser Calcite polarizzatore, 430-700nm	Newport	10GL08AR.14	1
Polarizzatore rotazione Monte	Newport	RM25A	1
¼ "distanziatore per 1" post diametro	Newport	PS-0.25	1
½ "altezza, 1" post diametro	Newport	PS-0.5	1
Forcella, 1 "post diametro	Newport	PS-F	1
Fascio di scarico	Newport	PL15	1
Microscopio Obiettivo Attacco obiettivo	Newport	LH-OBJ1	1
1 "messaggio di diametro, 1" height	Newport	PS-1	1
1 "di diametro della forcella postale	Newport	PS-F	1
Ad alta energia Nd: YAG laser Specchio, Diametro 25,4 mm, 45 °, 532 nm	Newport	10Q20HE.2	4
SUPREMA ottica Monte, diametro 1,0 pollici, foro passante di montaggio	Newport	SN100C-F	2
Alta precisione di regolazione a vite manopola, viaggi da 12,7 mm, 100TPI	Newport	AJS100-0.5K	4
Adattatore filettato, ¼ di sesso maschile -20, 8-32 femminile	Newport	SS-1-B	2
Rod Morsetto asta per 1,5 pollici di diametro	Newport	340-RC	2
Rod, 14 pollici (35,5 cm) di altezza	Newport	40	1
Vettore ferroviario, per X26, lunghezza 40 millimetri quadrati	Newport	CN26-40	4
Acciaio Rail, 384 millimetri (15 ") di lunghezza	Newport	X26-384	1
Piattaforma asta asta per 1,5 pollici di diametro	Newport	300-P	2
Rod, 14 pollici (35,5 cm) di altezza	Newport	40	2
Plano-Concave Lens, diametro 12,7 mm,-25mm EFL, 430-700nm	Newport	KPC025AR.14	2
Lente piano-convessa, diametro 25,4 mm, 50,2 millimetri EFL, 430-700nm	Newport	KPX082AR.14	1
Lente piano-convessa, diametro 25,4 mm, 62,9 millimetri EFL, 430-700nm	Newport	KPX085AR.14	1
Attacco obiettivo fisso, 0,5 "di diametro, 1.0" Asse altezza	Newport	LH-0.5	2
Attacco obiettivo fisso, 1,0 "di diametro, 1.0" altezza Axis	Newport	LH-1	2
Microsfere 0.1um	Polysciences	00876
Agarosio	RPI	A20090	EEO questioni
Muscimolo	Sigma	M1523