Culture Slice organotipica del mesencefalo ventrale embrionali: un sistema per studiare dopaminergici sviluppo neuronale In vitro</em

Sommario

Un metodo per generare fette organotipica dal mesencefalo murino embrionale E12.5 è descritto. Le culture fetta organotipica può essere usato per osservare il comportamento dei neuroni dopaminergici o di altri neuroni del mesencefalo ventrale.

Abstract

Il mouse è un organismo modello eccellente per studiare lo sviluppo del cervello dei mammiferi a causa della abbondanza di dati molecolari e genetici. Tuttavia, il cervello di topo in via di sviluppo non è adatto per una facile manipolazione e di imaging in vivo in quanto l'embrione del mouse è inaccessibile e opaco. Culture fetta organotipica di cervelli embrionali sono quindi ampiamente utilizzati per studiare lo sviluppo del cervello murino in vitro. Ex-vivo, la manipolazione o l'uso di topi transgenici permette la modifica dell'espressione genica in modo che le sottopopolazioni di cellule neuronali e gliali possono essere etichettati con proteine ​​fluorescenti. Il comportamento delle cellule etichettate possono essere osservate con time-lapse imaging. Time-lapse imaging è stata particolarmente efficace per lo studio dei comportamenti delle cellule che sono alla base dello sviluppo della corteccia cerebrale a fine fase embrionale ^1-2. Embrionale organotipica sistemi fetta della cultura nelle regioni del cervello al di fuori del prosencefalo sono establis menoHED. Pertanto, la ricchezza di time-lapse dati di immagini che descrivono la migrazione delle cellule neuronali è limitato al ^3,4 proencefalo. Non è ancora noto, se i principi scoperti per il cervello dorsale valere per le aree del cervello ventrale. Ventrale del cervello, i neuroni sono organizzati in gruppi neuronali, piuttosto che i livelli e spesso devono sottoporsi a complicate traiettorie migratorie per raggiungere la loro posizione finale. Il mesencefalo ventrale non è solo un buon sistema modello per lo sviluppo cerebrale ventrale, ma contiene anche le popolazioni neuronali come i neuroni dopaminergici che sono rilevanti nei processi di malattia. Mentre la funzione e la degenerazione dei neuroni dopaminergici è stato studiato in grande dettaglio nel cervello adulto e l'invecchiamento, poco si sa circa il comportamento di questi neuroni durante la fase di differenziazione e migrazione ^5. Descriviamo qui la generazione di culture fetta dal giorno embrionale (E) 12,5 mesencefalo ventrale del mouse. Queste fetta cultoUres siano potenzialmente idonei per il monitoraggio dello sviluppo dei neuroni dopaminergici per diversi giorni in vitro. Evidenziamo i passaggi critici nella generazione di fette di cervello in queste prime fasi di sviluppo embrionale e discutere le condizioni necessarie per mantenere il normale sviluppo dei neuroni dopaminergici in vitro. Abbiamo inoltre presentare i risultati di esperimenti di imaging lasso di tempo. In questi esperimenti, precursori mesencefalo ventrale (compresi i precursori dopaminergici) ed i loro discendenti sono stati etichettati in modo mosaico utilizzando un Cre / loxP basato destino sistema inducibile mappatura ^6.

Protocollo

Parti di questo protocollo sono modificate da Daza et al., 2007 ^7.

1. Preparativi

1. Possono essere preparati un giorno di anticipo
   1. Preparare 1X tampone Krebs (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH ₂ PO _4: H ₂ O, 1,2 mM MgCl _2, 2.5 mM CaCl _2, 11 mM glucosio, 25 mM NaHCO _3; aggiustare il pH a 7,4. Filtro sterilizzare (0,22 dimensione dei pori micron) e conservare a 4 ° C.
   2. Preparare il terreno di coltura (20 ml): 5 ml HBSS, 9 ml di glucosio DMEM alto, 850 ml di glucosio al 30%, 5 ml di siero di cavallo (2....

Discussione

Il metodo organotipica cultura fetta qui presentato fornisce un sistema di breve termine in analisi in vitro di neuroni dopaminergici e sviluppare le loro rotte migratorie e di proiezione nel mesencefalo ventrale embrionale. Abbiamo scoperto che ci sono una serie di passaggi critici nel protocollo che dovrebbe essere attentamente curato in modo da ottenere fette che permettono il normale sviluppo dei neuroni dopaminergici del mesencefalo ventrale. La fase più critica è la dissezione del cervello embrio.......

Materiali

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
Glucosio 30%	Sigma-Aldrich	G7528-250
Siero di cavallo	Invitrogen	26050-088
DMEM (4,5 g / L Glc., Con L-Gln, Na Pyr, NaHCO3)	Sigma-Aldrich	D6429-500
Penicillina / streptomicina 100x	Sigma-Aldrich	P4333-20
Acido L-ascorbico	Sigma-Aldrich	A4403	preparare magazzino 200mm e conservare a -20 ° C
Ultrapura agarosio LMP	Invitrogen	15517-022
Millicel inserti	Millipore	PICMORG50
μ-piatto 35 mm, a basso	Ibidi	80136
Vibratome	Microm	HM 650V
Lametta	Plano GmbH	121-6
Histoacryl colla	BRAU9381104	Braun Aesculap
Spoon Dia perforata diametro 15 mm	Strumenti Scienza multa	10370 -18
Pinza 5 Dumoxel	Strumenti Scienza multa	11252-30

Nome dell'anticorpo	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Coniglio anti-tirosina idrossilasi	Millipore	AB152	Diluizione 1:500
Topo anti-tirosina idrossilasi	Millipore	MAB318	Diluizione 1:500
Topo anti-BrdU	BD Pharmingen	555627	Diluizione 1:200
Coniglio anti-caspasi 3 spaccati	Tecnologia delle celle di segnalazione	9661	Diluizione 1:200
Donkey anti-IgG di coniglio-Alexa 488	Invitrogen	A21206	Diluizione 1:500
Donkey IgG anti-topo-Cy3	Jackson ImmunoResearch	715-165-150	Diluizione 1:200