Qui vi proponiamo semplici metodi per testare e valutare la presenza di specie reattive dell'ossigeno nelle cellule.
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Articolo metodologico
Produzione e di rilevamento di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in Cancro
In questo articolo
Sommario
Abstract
Specie reattive dell'ossigeno comprendono un certo numero di molecole che danno al DNA e RNA e ossidare le proteine e lipidi (perossidazione lipidica). Queste molecole contengono reattive di ossigeno e comprendono H 2 O 2 (perossido di idrogeno), NO (ossido nitrico), O 2 - (anione ossido), il perossinitrito (ONOO -), acido hydrochlorous (HOCl), e radicale ossidrile (OH -) .
Specie ossidativo sono prodotte non solo in situazioni patologiche (cancro, riperfusione ischemica /, patologie neurologiche e cardiovascolari, malattie infettive, malattie infiammatorie 1, malattie autoimmuni 2, ecc ...) ma anche in situazioni fisiologiche (non patologico), come il metabolismo cellulare 3 , 4. Infatti, ROS svolgono un ruolo importante in molti pathway di segnale cellulare (proliferazione, l'attivazione delle cellule 5, 6, 7 migrazione ecc.). ROS può essere dannoso (è poi indicato come"Stress ossidativo e nitrosativo") se prodotti in grandi quantità nel compartimento intracellulare e delle cellule generalmente rispondono a ROS da upregulating antiossidanti come la superossido dismutasi (SOD) e catalasi (CAT), glutatione perossidasi (GPx) e glutatione (GSH) che protegge li convertendo pericolosi radicali liberi in molecole innocue (cioè acqua). Vitamine C ed E sono anche stati descritti come spazzini ROS (antiossidanti).
I radicali liberi sono utili in quantità bassa 3. Macrofagi e neutrofili-mediata risposte immunitarie coinvolgere la produzione e il rilascio di NO, che inibisce i virus, agenti patogeni e la proliferazione del tumore 8. NO reagisce anche con altri ROS e, quindi, ha anche un ruolo come disintossicante (ROS scavenger). Infine NO agisce sui vasi di regolare il flusso di sangue che è importante per l'adattamento del muscolo per l'esercizio fisico prolungato 9, 10. Diverse pubblicazioni hanno anche dimostrato che i ROS sono coinvolti in sens insulinaitivity 11, 12.
Numerosi metodi per valutare la produzione di ROS sono disponibili. In questo articolo proponiamo alcuni test semplice, veloce e conveniente, questi test sono state convalidate da molte pubblicazioni e sono abitualmente utilizzati per rilevare ROS o dei suoi effetti in cellule di mammifero. Mentre alcuni di questi saggi di rilevare molteplici ROS, altri rilevano un solo ROS.
Protocollo
1. Rilevamento di ROS mediante carbossi-H 2 DCFDA
Carbossi-H 2 DCFDA non è fluorescente ma in presenza di ROS, quando questo reattivo viene ossidato, diventa verde fluorescente.
- Immediatamente prima dell'uso, preparare una soluzione fresca stock di carbossi-H 2 DCFDA in sterili dimetilsolfossido (DMSO) o 100% di etanolo. Evitare di più disgelo / cicli di congelamento del colorante.
- Lavare le cellule con soluzione salina tamponata HEPES (HBSS) o tampone fosfato salino (PBS) per rimuovere le tracce del mezzo originale.
- Caricare le cellule con il colorante (e la tintura di contr....
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Discussione
Diverse situazioni patologiche come le malattie infiammatorie, tumori, l'ischemia / riperfusione, ed anche trattamenti come la radioterapia o la chemioterapia (cisplatino cioè) inducono sovrapproduzione ROS. Così, il rilevamento e la misurazione dei livelli di ROS è importante in molte di base, gli studi pre-clinici e clinici. Tuttavia, ROS hanno tempi di dimezzamento molto breve e potrebbe essere complicata da rilevare. Qui, proponiamo semplici test che vengono utilizzati di routine e ampiamente accettato per la ri.......
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Dichiarazioni
Abbiamo ricevuto l'appoggio di Promega per questa pubblicazione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (CA142664).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| 5 - (e-6)-carbossi-2 ', 7'-diclorofluoresceina diacetato (carbossi-DCFDA) | Molecular Probes | C369 | controllo |
| carbossi-H 2 DCFDA | Molecular Probes | C400 | |
| Sulfanilamide | Sigma | S9251-100G | |
| N-1-napthylethylenediamine dicloridrato | Sigma | N9125-10G | |
| Nitriti di serie | Sigma | 237213-100G | |
| GSH / GSSG-Glo Assay | Promega | V6612 | Per quantificare ossidato, ridotto o ossidato / glutatione ridotto |
Riferimenti
- Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).
- Perl, A., Gergely, P., Banki, K. Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythem....
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Ristampe e permessi
