Diretto Cellular Self-Assembly di fabbricare Cell-Derived Anelli tessuto per l'analisi biomeccanica e di ingegneria dei tessuti

Sommario

Questo articolo descrive un metodo versatile per creare cellule derivate da anelli di tessuto cellulare self-assembly. Cellule muscolari lisce seminate in forma di anello aggregato agarosio pozzi e contratto a formare solide tridimensionali (3D) nei tessuti entro 7 giorni. Millimetrica scala anelli di tessuto sono favorevoli ai test meccanici e servono come mattoni per l'assemblaggio dei tessuti.

Abstract

Ogni anno, centinaia di migliaia di pazienti sottoposti ad intervento di bypass coronarico negli Stati Uniti ^1. Circa un terzo di questi pazienti non hanno vasi adatti donatore autologo a causa della progressione della malattia o raccolto precedente. Lo scopo di ingegneria dei tessuti vascolari è quello di sviluppare una fonte alternativa adatta per questi innesti di bypass. Inoltre, il tessuto vascolare progettato può risultare prezioso come modelli viventi vascolare per lo studio delle malattie cardiovascolari. Diversi approcci promettenti ai vasi sanguigni di ingegneria sono state esplorate, con molti studi recenti incentrati sullo sviluppo e l'analisi di metodi basati su celle. ^2-5 Qui, presentiamo un metodo rapido per auto-assemblano in anelli cellule del tessuto 3D che possono essere utilizzati in vitro per modellare i tessuti vascolari.

Per fare questo, sospensioni di cellule muscolari lisce sono seminate in fondo rotondo anulare agarosio pozzi. La non-adesivo proprietà del agarosio permettono °cellule e per risolvere, aggregare e contratto intorno ad un perno posto al centro del pozzo per formare un anello coeso tessuto. ^6,7 Questi anelli possono essere coltivate per diversi giorni prima della raccolta per i meccanici, fisiologica, l'analisi biochimica, o istologici. Abbiamo dimostrato che questi derivati ​​dalle cellule del tessuto anelli rendimento a 100-500 la resistenza alla trazione kPa ultimo ^8, che supera il valore riportato per altri costrutti vascolari di ingegneria tessutale in coltura per eguali periodi (<30 kPa). ^9,10 I nostri risultati dimostrano che la cellula robusta di derivazione vascolare generazione anello di tessuto può essere raggiunto entro un breve periodo di tempo, e offre l'opportunità di valutazione diretta e quantitativa dei contributi di cellule e derivati ​​dalle cellule della matrice (CDM) di struttura del tessuto vascolare e funzione.

Protocollo

1. Cellula semina fabbricazione dello stampo

Iniziare mediante fresatura da un 1 / 2 "pezzo spesso di policarbonato per creare 15, a fondo tondo, pozzi anulare con diametro del perno di centraggio di 2 mm. I canali fresato sono 6 mm di profondità e 3,75 millimetri di larghezza. Pulire e asciugare lo stampo in policarbonato per rimuovere eventuali residui di plastica dal processo di fresatura.

Mix polidimetilsilossano (PDMS) con un rapporto 10:1 (w / w) di base a catalizzatore, Degas per rimuovere tutte le bolle d'aria, e versare sopra lo stampo in policarbonato. Degas di nuovo per rimuovere eventuali bolle rimanenti, e la cura in forno a 60 ° C per 4 ore.

Una volta indurito, rimuovere con attenzione il modello da PDMS lentamente peeling dal policarbonato, lavare con acqua e sapone, e autoclave. Anche autoclave una soluzione di agarosio per cento due (w / v) disciolto in Dulbecco modificato (DMEM).

Posizionare il modello PDMS su una superficie piana e riempire con fuso aga è aumentato del primo pipettaggio agarosio in ciascuno dei stampi posta al centro, e poi pipettaggio nello spazio intorno ad esso. Lasciare solidificare l'agarosio (circa 15 minuti), poi capovolgere lo stampo per liberare l'agarosio dal PDMS. Tagliare l'eccesso di agarosio di tutto ognuno dei pozzi, i pozzi e il luogo di agarosio in 12-pozzetti.

2. Coltura cellulare e semina anello

Aggiungi coltura cellulare media (DMEM con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina) intorno alla parte esterna dello stampo agarosio, senza coprire la parte superiore degli stampi. Posizionare le piastre nell'incubatore e permettere loro di equilibrare per circa 15 minuti mentre preparate le cellule.

Al 90% confluenza, trypsinize topo cellule muscolari lisce aortiche (rSMCs) e risospendere ad una concentrazione di 5x10 ⁶ cellule / ml. Pipettare 100 l di sospensione cellulare in ciascuno dei anulare agarosio pozzi, con un movimento circolare per applicare le cellule in ogni pozzetto.

contenuto "> Assicurarsi che gli scaffali sono incubatore livello, quindi posizionare le piastre nell'incubatrice e permettere loro di riposare per 24 ore. medium Cambio ogni due giorni successivi aspirando i media di tutto il bene, e ri-riempire ogni bene fino alla agarosio bene è completamente sommerso.

3. Tessuto raccolta anello e misure di spessore

A conclusione della cultura, rimuovere l'anello dallo stampo agarosio facendolo scorrere sopra la parte superiore del montante centrale.

Posizionare l'anello in una piccola scatola di Petri con tampone fosfato (PBS), centro del campione, e acquisire un'immagine utilizzando un sistema di imaging digitale.

Utilizzare un programma di analisi delle immagini per il rilevamento dei bordi e misurare lo spessore dell'anello in 4 posizioni (alto, basso, sinistra e destra) lungo la sua circonferenza. Calcolare il valore medio spessore (t) per ogni singolo anello, e usare questo valore per calcolare la sezione trasversale(2π (t / ²⁾ 2).

4. Prove meccaniche di anelli

Impostare la macchina di prova a trazione (Instron EPS 1000) in posizione orizzontale. Collegare un 1N ± 1mn cella di carico e personalizzati impugnature filo sottile (creato da piegare filo di acciaio inossidabile).

Montare l'anello di campione sulle due impugnature filo sottile. Estendere le prese fino a 5 mN carico tara è applicata al campione. Inserire la sezione trasversale (in base a misurazioni di spessore) e registrare il tratto utile.

Pre-ciclo gli anelli 8 volte tra il carico di stress tara e 50 kPa ad una velocità di 10 mm / min. Dopo l'ottavo pre-ciclo, tirare al fallimento a 10 mm / min. Il fallimento è notato come una diminuzione della forza del 40% da una misura all'altra. Per ogni campione anello, misurare lo sforzo finale trazione (UTS) e tensioni fallimento e calcolare il massimo tangente modulo (MTM) a partire dai dati acquisiti.

5. Tessuto anellotaggio per fabbricare tubi di tessuto

Portaprovette personalizzati sono lavorati da rotondo 5 centimetri dischi di policarbonato con ritagli rettangolari (2 cm x 3 cm). Praticare i fori filettati con questi dischi per consentire a due titolari di essere avvitati insieme. Autoclave i titolari tubo personalizzato e quindi il trasferimento al mobile biosicurezza e metterlo in un piatto vuoto Petri.

Usare le forbici chirurgiche per tagliare le estremità dei tubi di 1,9 mm di diametro in silicone con un angolo per creare bordi smussati, e poi in autoclave i tubi in silicone. Mentre i tubi sono stati sterilizzati in autoclave, riempire una piastra di Petri con i media.

Rimuovere gli anelli dai pozzi agarosio e metterli nella scatola di Petri con i media. Luogo in autoclave i tubi di silicone nello stesso piatto di Petri per bagnare prima dell'uso.

Utilizzare pinze per mettere un fine smussata di un tubo di silicone al centro di un anello e far scorrere l'anello sul tubo in silicone. Ripetere con il numero desiderato di riNGS. Far scorrere gli anelli in contatto uno con l'altro da delicatamente spingendo successivamente in entrambe le direzioni lungo il tubo. Questo metodo può essere utilizzato per gli anelli raccolti dopo un solo giorno in coltura.

Una volta che gli anelli sono montati, allineare i tubi di silicone all'interno della titolari policarbonato e avvitare le due parti del titolare insieme. Posizionare il supporto in un piatto di 100 mm di Petri e aggiungere 55 ml multimediali. Scambio dei media ogni 3 giorni per la durata della cultura.

Per rimuovere i tubi di tessuto, rilasciare i tubi in silicone dal supporto in policarbonato e utilizzare pinze per far scorrere i tubi di tessuto dal tubo in silicone e in una piastra di Petri riempite con PBS.

6. Rappresentante dei risultati:

Quando il protocollo è eseguita correttamente, le cellule si aggregano formando anelli di tessuto con un diametro interno uguale al diametro del perno stampo corrispondente entro 24 ore. I bordi lisci ad anello sono di solito in apparenza e (se cultured su una superficie piana), sono di spessore uniforme lungo l'intero perimetro. Gli anelli di tessuto sono facili da gestire e possono essere rimossi dai loro pozzi per le successive analisi meccaniche e istologiche (v., in Gwyther et al. 2011, ^8). Anello morfologia del tessuto, la composizione della matrice, e le proprietà meccaniche variano a seconda del numero e del tipo di cellule inseminate.

Risultati rappresentativi da anelli di tessuto a base di diversi tipi di cellule, semina le condizioni, e la lunghezza della cultura sono riportati nella tabella 1. Due anelli mm ID creato da 5x10 ⁵ rSMCs esibito un carico di rottura superiore a quello anelli creati dalla nostra precedentemente pubblicato con 2 anelli mm (fatto da 6.6x10 ⁵ rSMCs). Simili alle cellule di ratto, cellule muscolari lisce (HSMC) ⁸ facilmente aggregate per formare il tessuto Anelli, che conteneva una grande quantità di collagene dopo soli 14 giorni in coltura (dati non riportati). Cellule staminali mesenchimali (hMSC) anche aggregati e formano anelli coesa, ma lacked resistenza meccanica e si è rotto durante le fasi iniziali di precycling prove di trazione uniassiale.

	n	Numero di cellule	Spessore (mm)	Lunghezza della cultura (giorni)	UTS (kPa)	MTM (kPa)	Il mancato ceppo (mm / mm)
rSMC anelli	6	660.000	0,94 ± 0,12	14	97 ± 30	497 ± 91	0,50 ± 0,08
rSMC anelli	4	500.000	0,53 ± 0,02	7	113 ± 8	189 ± 15	0,88 ± 0,05
HSMC anelli	3	750.000	0,51 ± 0,05	14	160 ± 30	270 ± 20	0,92 ± 0,08
hMSC anelli	3	750.000	0,40 ± 0,07	14	N / A	N / A	N / A

Tabella 1. Tabella che mostra i parametri della cultura e delle proprietà meccaniche dei 2 anelli millimetri generate da diversi tipi di cellule, le concentrazioni di semina, e durate la cultura.

Figura 1. (A) Schema del processo di generazione dei tessuti anello. (B) Personalizzato stampo in policarbonato con fresata pozzi anulare. Diametri postale centrale sono 2 mm. (C) PDMS modello dopo che è stato staccato dallo stampo in policarbonato. (D) anello di tessuto aggregati in coltura in uno stampo agarosio con un post 2 mm. (E) Due millimetri di diametro anello di tessuto in PBS. Barre di scala = 6 mm (B, C) e 2 mm (D, E).

Figura 2. Trama rappresentante della curva produttori sforzo-deformazioneced da prove di trazione uniassiale.

Discussione

Recentemente, c'è stato un crescente interesse a base di cellule o "patibolo-less" metodi di ingegneria tissutale per affrontare alcuni dei limiti degli approcci tessuto ponteggio a base di ingegneria. Dato che derivati ​​dalle cellule dei tessuti vengono create dalle cellule e la matrice che producono, che contengono intrinsecamente molto più alta densità di cellulari, non contengono materiali esogeni, e può essere realizzato interamente in cellule umane e proteine. Innesti vascolari costituito da cellule umane possono raggiungere notevoli resistenze meccaniche in assenza di ponteggi esogeni (per esempio, pressioni di scoppio 3400 mmHg rispetto a 1600 mmHg per l'uomo safene) ^12. Anche se i tessuti vascolari a base di cellule mostrano densità cellulare migliorata e resistenza meccanica, metodi di fabbricazione più recente (come "foglio-based engineering" ^3,4,12 o "bioprinting" ^5,13) richiedono periodi di cultura estesa (> 3 mesi) o attrezzature specializzate per la costruzione del tessuto 3D. I derivati ​​dalle cellule del tessuto anello method qui descritto consente una rapida cellulari auto-assemblaggio a formare solide costruzioni tessuto 3D in un breve periodo di tempo e senza l'uso di attrezzature specializzate.

Questo protocollo in dettaglio la procedura che abbiamo sviluppato per creare 2 millimetri di diametro interno ratto liscia derivati ​​dalle cellule del tessuto muscolare anelli. Nel presente esempio, anelli di tessuto sono stati coltivati ​​per 7 giorni (poi coltivate per altri 7 giorni per la fusione anello e la formazione del tubo). Tuttavia, 2 ratti mm (e umano) delle cellule muscolari lisce anelli possono essere rimosse dai pozzi e sono abbastanza coesa per la gestione (ad esempio, il trasferimento su tubi in silicone) già un giorno dopo la semina delle cellule. Inoltre, gli anelli di tessuto robusto con diversi diametri interni (2, 4 e 6 mm) possono essere creati con questo metodo semplicemente cambiando il diametro posto di stampo originale in policarbonato. ⁸ Abbiamo anche recentemente modificato la progettazione dello stampo in policarbonato per consentire cinque 2 millimetri pozzi semina per essere gettati in un unico multi-bene agarosio camera, cheutilizza meno PDMS e agarosio, e si inserisce in un pozzetto di un 6-pozzetti (dati non riportati). Le variazioni di diametro posta, la larghezza della semina bene, il raggio di curvatura del fondo arrotondato, il numero di pozzetti semina, o la profondità dei pozzi di semina possono essere modificati semplicemente cambiando le specifiche del file CAD per CNC lavorazione dello stampo in policarbonato. Infine, un unico stampo in policarbonato può essere usato per fabbricare un numero illimitato di modelli PDMS, PDMS e ogni template può essere pulito, autoclave e riutilizzati decine di volte.

Oltre a modificare la dimensione degli anelli di tessuto, abbiamo fatto gli anelli da molti tipi di cellule diverse, tra cui: SMC primari di ratto (Applicazioni Cell, R354-05), primaria SMC umano coronarica (Lonza, CC-2583), umano primario fibroblasti dermici ¹¹ (dono generoso del dottor George Pins, WPI Dipartimento di Ingegneria Biomedica), fibroblasti di polmone di ratto (RFL-6, ATCC CCL-192), e le cellule staminali mesenchimali (Lonza, PT-2501). Ognuno di questi tipi di aggregati cellulari e contratti di tutto il centro messaggi per formare anelli di tessuto, anche se l'organizzazione cellulare, composizione ECM, e le proprietà meccaniche dei costrutti variano per ogni tipo di cellula. I parametri di semina per ciascun tipo di cella deve essere empiricamente determinato sulla base della dimensione delle celle e la loro capacità di aggregare. Pertanto, mentre questo sistema di creazione di cellule derivate anelli tessuto è estremamente versatile, il protocollo può avere bisogno di piccoli aggiustamenti formazione di tessuto ottimale con diversi tipi di cellule.

Anello geometria tessuto facilita il caricamento facile e valutazione delle proprietà dei materiali tessuti da prove di trazione uniassiale, come descritto. Ci sono anche precedenti sostanziale per l'utilizzo di segmenti di anello di vasi sanguigni per misurare la contrazione vascolare e funzione fisiologica. Studi preliminari indicano che derivati ​​dalle cellule anelli di tessuto può essere montato su un dispositivo miografo fili per la misura di risposta farmacologica eforza contrattile generazione (dati non riportati). Complessivamente, la capacità di fabbricare rapidamente auto-assemblati anelli di cellule per l'analisi istologica, meccanici, fisiologici, biochimici e suggerisce un nuovo e potente strumento che può essere utile per modellare la struttura del tessuto vascolare e la funzione nella salute e nella malattia.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente / apparecchiatura	Azienda	Catalogo
Polidimetilsilossano (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Agarosio	Lonza	50000
DMEM	Mediatech	15-017-CV
Siero fetale bovino (FBS)	PAA	A05-201
Penicillina / streptomicina	Mediatech	30-002-CI
Sistema di imaging digitale	DVT Corporation	Modello 630
Collaudo della macchina monoassiale	Instron	ElectroPuls E1000
Rilevamento dei bordi Software	DVT Corporation	Framework 2.4.6