La citometria a flusso è uno strumento potente che consente l'isolamento e lo studio di popolazioni cellulari specifiche. Questo protocollo descrive i passaggi per isolare cellule esprimenti LacZ da tessuti cocleari di topi transgenici neonati. Le cellule cocleari dissociate sono state marcate utilizzando substrati fluorescenti coniugati della β-galattosidasi prima della separazione mediante citometria a flusso.
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Articolo metodologico
Isolando LacZ cellule che esprimono da tessuti dell'orecchio interno del mouse in citometria a flusso
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'isolamento di tipi cellulari specifici consente di analizzare popolazioni cellulari rare, come le cellule staminali o progenitrici. Tale approccio allo studio dei tessuti dell'orecchio interno presenta una sfida unica a causa della scarsità delle cellule di interesse e del numero limitato di modelli di topi transgenici reporter. Di seguito descriviamo un protocollo che utilizza sonde coniugate a fluorescenza per etichettare selettivamente le cellule positive per LacZ provenienti dai coclei neonatali.
La patologia sottostante più comune della perdita dell'udito di tipo neurosensoriale è il danno irreversibile e la perdita delle cellule ciliate sensoriali cocleari, necessarie per trasdurre le onde sonore in impulsi neurali. Evidenze recenti suggeriscono che gli organi uditivi e vestibolari dei topi ospitano cellule staminali/progenitrici che potrebbero avere potenzialità rigenerative1,2. Questi risultati giustificano ulteriori indagini, inclusa l'identificazione di specifici tipi cellulari con caratteristiche di cellule staminali/progenitrici. È stato dimostrato che la via di segnalazione Wnt svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento delle popolazioni di cellule staminali/progenitrici in diversi sistemi organici3-7. Abbiamo recentemente identificato cellule esprimenti Axin2 sensibili alla via Wnt nella coclea neonatale, ma la loro funzione è per lo più sconosciuta8.
Per comprendere meglio il comportamento di queste cellule sensibili alla via Wnt in vitro, abbiamo sviluppato un metodo per isolare cellule che esprimono Axin2 dalla coclea di topi reporter Axin2-LacZ9. Utilizzando la citometria a flusso per isolare cellule positive per Axin2-LacZ dalle coclee neonatali, siamo in grado di eseguire una varietà di esperimenti su cellule vive al fine di analizzarne il comportamento come cellule staminali/progenitrici. Qui descriviamo in dettaglio le fasi per la microdissezione della coclea neonatale, la dissociazione di questi tessuti, l'etichettatura delle cellule positive per LacZ mediante un substrato fluorogenico e il sorting cellulare. Tecniche per la dissociazione della coclea in cellule singole e per l'isolamento di cellule cocleari mediante citometria a flusso sono già state descritte2,10-12. Abbiamo apportato modifiche a queste tecniche per stabilire un protocollo innovativo per l'isolamento di cellule che esprimono LacZ dalla coclea neonatale.
Protocollo
1. Microdissezione della coclea
- Preparare il microscopio per dissezione sotto cappa aspirante pulendo le superfici con etanolo al 70% e posizionando blocchi di ghiaccio.
- Preparare 10-15 piastre di Petri da 35 mm in condizioni sterili e riempirle a metà (~2 ml) con soluzione salina equilibrata di Hank contenente calcio (HBSS) sterile.
- Preparare due piastre di Petri da 35 mm in condizioni sterili e riempirle a metà (~2 ml) con soluzione fosfato tampone sterile 1x (PBS).
- Sterilizzare le micropinze in un tubo conico Falcon da 50 ml contenente etanolo al 70%.
- In una stanza separata dalla cappa sterile, utilizzare forbici ....
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Discussione
Studi di ricerca indipendenti hanno descritto una capacità rigenerativa limitata all'interno dei coclei neonatali2,10,12,13. Utilizzando topi con reporter GFP e la citometria a flusso, White e colleghi hanno isolato specifiche cellule di sostegno cocleari, riscontrando in esse caratteristiche di cellule progenitrici12.
È stato dimostrato che la via canonica di Wnt identifica popolazioni di cellule staminali/progenitrici in diversi sistemi organici, tra cui il cervello, la.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Ringraziamo S. Heller, K. Oshima, R. Nusse e Y. Zeng per le discussioni fruttuose e C. Tang, A. Lee, E. Liaw e il personale della Stanford Shared FACS Facility per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Howard Hughes Medical Institute Medical Research Training Fellowship, dal programma Stanford University Medical Scholars (entrambi assegnati a T.A.J.), dalla Stanford University Dean's Fellowship (assegnata a R.C.), dalla American Otological Society, dalla Triological Society, dal Percy Memorial Award, dal Akiko Yamazaki e Jerry Yang Faculty Scholar Fund e dal NIDCD/NIH K08 DC011043 (tutti assegnati ad A.G.C.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piatto di Petri, polistirene, sterile Geriner Bio-one 35 x 10 mm | VWR international | 82050-540 | |
| BD Falcon Filtri cellulari, sterili, BD Biosciences, blu, 40 μm | VWR international | 21008-949 | |
| Hanks’ Soluzione salina equilibrata (HBSS). Soluzione con calcio, magnesio e senza rosso fenolo, sterile | VWR international | 45000-456 | |
| Tubi da centrifuga Cellstar, in polipropilene, sterili, Greiner Bio-One, 50 ml | VWR international | 82050-346 | |
| Tubi da centrifuga Cellstar, in polipropilene, sterili, Greiner Bio-One, 15 ml | VWR international | 82050-278 | |
| Integratore privo di siero B-27 (50x), liquido | Invitrogen | 17504-044 | |
| Supplemento N-2 (100x), liquido | Invitrogen | 17502-048 | |
| bFGF, fattore di crescita dei fibroblasti basico umano | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| IGF-1, fattore di crescita simile all'insulina-1 da topo | Sigma-Aldrich | I8779 | |
| EGF, fattore di crescita epidermico umano | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Dulbecco’s Eagle modificato’s Medium/Ham’s F-12 50/50 Mix: 1X, con L-Glutammina e 15 mM HEPES | VWR international | 45000-350 | |
| BD Falcon Provette con fondo rotondo, monouso, in polistirene, 12x75 | VWR international | 60819-295 | |
| Tripsina, 0,25% (1X) con EDTA 4Na, liquida | Invitrogen | 25200-056 | |
| ep Dualfilter TIPS 300 µL, 960 TIPS | Eppendorf | 22491245 | |
| Inibitore della tripsina, soia, purificato | Worthington Biochemical | LS003570 | |
| BD Falcon Retini cellulari da 40 µm | BD Biosciences | 21008-949 | |
| Piastre multipozzetto, in polistirene, Greiner Bio-One, piastre non trattate, 6 pozzetti | VWR international | 82050-846 | |
| Kit per la rilevazione del marcatore genetico FACS Blue beta-galattosidasi LacZ | Tecnologie per i Geni Marcatori | M0255 |
Riferimenti
- Li, H., Liu, H., Heller, S. Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear. Nat. Med.. 9, 1293-1299 (2003).
- Oshima, K. Differential distribution of stem cells in the auditory and vestibular organs of the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol
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Ristampe e permessi
