Isolando LacZ cellule che esprimono da tessuti dell'orecchio interno del mouse in citometria a flusso

Sommario

La citometria a flusso è un potente strumento che consente l'isolamento e lo studio di specifiche popolazioni cellulari. Questo protocollo descrive i passaggi per isolare le cellule che esprimono LacZ dai tessuti cocleari di topi transgenici neonati. Le cellule cocleari dissociate sono state marcate utilizzando substrati coniugati fluorescenti di β-galattosidasi prima della separazione tramite citometria a flusso.

Abstract

L'isolamento di specifici tipi di cellule permette di analizzare popolazioni cellulari rare come le cellule staminali/progenitrici. Un tale approccio allo studio dei tessuti dell'orecchio interno presenta una sfida unica a causa della scarsità di cellule di interesse e dei pochi modelli murini reporter transgenici. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza sonde coniugate a fluorescenza per marcare selettivamente le cellule LacZ-positive dalle coclee neonatali.

La patologia sottostante più comune dell'ipoacusia neurosensoriale è il danno irreversibile e la perdita delle cellule ciliate sensoriali cocleari, necessarie per trasdurre le onde sonore in impulsi neurali. Prove recenti suggeriscono che gli organi uditivi e vestibolari murini ospitano cellule staminali/progenitrici che possono avere un potenziale rigenerativo^1,2. Questi risultati giustificano ulteriori indagini, compresa l'identificazione di tipi cellulari specifici con caratteristiche di cellule staminali/progenitrici. È stato dimostrato che la via di segnalazione Wnt svolge un ruolo critico nel mantenimento delle popolazioni di cellule staminali/progenitrici in diversi sistemi di organi^3-7. Abbiamo recentemente identificato cellule che esprimono Axin2 Wnt-responsive nella coclea neonatale, ma la loro funzione è in gran parte sconosciuta⁸.

Per comprendere meglio il comportamento di queste cellule Wnt-responsive in vitro, abbiamo sviluppato un metodo per isolare le cellule che esprimono Axin2 dalle coclee di topi reporter Axin2-LacZ⁹. Utilizzando la citometria a flusso per isolare le cellule positive Axin2-LacZ dalle coclee neonatali, potremmo a nostra volta eseguire una varietà di esperimenti su cellule vive per interrogare il loro comportamento come cellule staminali/progenitrici. Qui, descriviamo in dettaglio le fasi per la microdissezione della coclea neonatale, la dissociazione di questi tessuti, la marcatura delle cellule LacZ-positive utilizzando un substrato fluorogenico e lo smistamento cellulare. Sono state descritte tecniche per dissociare le coclee in singole cellule e isolare le cellule cocleari tramite citometria a flusso^2,10-12. Abbiamo apportato modifiche a queste tecniche per stabilire un nuovo protocollo per isolare le cellule che esprimono LacZ dalla coclea neonatale.

Protocollo

1. Microdissezione della coclea

1. Preparare il microscopio di dissezione sotto il cofano strofinando le superfici con etanolo al 70% e posizionando i blocchi di ghiaccio.
2. Preparare 10-15 piastre di Petri da 35 mm in condizioni sterili e riempirle a metà (~2 ml) con la soluzione salina bilanciata sterile di Hank con calcio (HBSS).
3. Preparare due piastre di Petri da 35 mm in condizioni sterili e riempirle a metà (~2 ml) con 1x soluzione tamponata con fosfato (PBS) sterile.
4. Sterilizzare le micropinze in una provetta Falcon conica da 50 ml con etanolo al 70%.
5. In una stanza separata dal cappuccio sterile, utilizzare le forbici dell'iride per decapitare 12-15 topi reporter Axin2^LacZ/+ postnatali (P) di 0-3 giorni e posizionare le teste su una capsula di Petri da 60 mm su un blocco di ghiaccio.
6. Usando la pinza Dumont #5 e le forbici dell'iride, asportare la mandibola e la lingua e tagliare la base del cranio a livello del palato.
7. Rimuovere la pelle sovrastante della calvaria e sezionare la base del cranio inserendo le forbici nella parte inferiore del forame magno al centro del palato.
8. Praticare un'altra incisione con le forbici dell'iride dal bordo tagliato del palato alla faccia superiore della calvaria su entrambi i lati, facendo attenzione a non danneggiare la capsula otica.
9. Isolamento completo dell'osso temporale mediante l'esecuzione di due incisioni angolate di 45 gradi a partire dalla faccia superiore del forame magno che si estende fino al taglio coronale al palato duro.
10. Posizionare le ossa temporali isolate in piastre di Petri da 35 mm contenenti HBSS su un blocco di ghiaccio.
11. Raccogli le ossa temporali da circa 12-15 animali che sono stati sacrificati, per un totale di 24-30 ossa temporali.
12. Trasferire la capsula di Petri con le ossa temporali isolate in una cappa di dissezione sterile precedentemente preparata (1.1).
13. Trasferire quattro ossa temporali in ciascuna capsula di Petri da 35 mm pre-preparata contenente HBSS (1.2) e posizionarle su un blocco di ghiaccio.
14. Iniziare la microdissezione utilizzando due pinze #55 per rimuovere delicatamente la corteccia, il tronco encefalico e il cervelletto nell'osso temporale sovrastante la capsula otica.
15. Senza rimuovere la capsula otica, staccare le parti della capsula cocleare iniziando dall'ingresso del nervo vestibolococleare nella capsula otica.
16. Dopo l'esposizione della base della coclea, estrarre delicatamente la coclea e i tessuti circostanti. Rimuovere il ganglio a spirale rimanente e la stria vascolare iniziando dalla base.
17. Trasferire la coclea in una capsula di Petri da 35 mm contenente PBS su blocco di ghiaccio.
18. Per una vitalità tissutale ottimale, il tempo totale di dissezione deve essere inferiore a 60 minuti.
19. Ripetere i passaggi precedenti per 3-5 topi P0-P3 wild-type (WT) come controlli per i topi Axin2-LacZ.

2. Dissociazione cellulare (modificata rispetto ai metodi precedentemente descritti)^2,10

1. Posizionare 50 μl di PBS sterile al centro di un pozzetto in una piastra di coltura non rivestita a 6 pozzetti.
2. Trasferire fino a 20 coclee^{Axin2 LacZ/+} in ogni goccia da 50 μl di PBS. Una nuova goccia da 50 μl di PBS dovrebbe essere utilizzata per più di 20 coclee.
3. Preriscaldare 50 μl di aliquote di tripsina allo 0,125% per ~2 minuti in un bagno d'acqua a 37°C.
4. Aggiungere 50 μl di tripsina preriscaldata allo 0,125% al PBS contenente le coclee.
5. Posizionare la pirofila a 6 pozzetti a 37°C per 8 minuti, facendo attenzione a non scuotere la pirofila.
6. Per terminare la tripsinizzazione, aggiungere 50 μl di inibitore della tripsina di soia a ciascuna gocciolina da 100 μl.
7. Aggiungere altri 50 μl di Full Media (FM) (IGF-1, EGF, bFGF, HS, ampicillina in DMEM/F12)²
8. Utilizzando un puntale per pipetta smussato da 300 μl con un pipettatore p200 impostato a 125 μl, triturare delicatamente le cellule 80 volte, facendo attenzione a non creare bolle.
9. Dopo la triturazione di ciascuna gocciolina, aggiungere altri 200 μl di FM a ciascun pozzetto.
10. Far passare le cellule attraverso un filtro cellulare Falcon blu da 40 μm in un nuovo pozzetto.
11. Trasferire le celle in provette Falcon FACS standard (rimangono circa 300 μl dopo la triturazione e la filtrazione).
    1. Dividere le cellule delle coclee wildtype in tre provette, diluendo 100 μl con 300 μl FM in ciascuna provetta. Una provetta sarà utilizzata come controllo in bianco, una sarà colorata solo con ioduro di propidio (PI, 1 μg/ml) (da non aggiungere in questa fase), mentre l'ultima sarà colorata con 3-carbossiumbelliferil β-D-galattopiranoside (CUG, vedi 2.15) per rilevare la fluorescenza di fondo.
    2. Inserire 400 μl di cellule dissociate dalle coclee Axin2-LacZ in ciascuna provetta FACS. Come controllo solo CUG, diluire 10 μl di cellule in 390 μl FM (vedere la provetta F al punto 2.15). Portare il volume delle provette rimanenti a 400 μl.
12. Incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37°C per 10 minuti.
13. Preparare la soluzione CUG:
    1. Preparare 200 μl di CUG per ogni provetta FACS che richiede la colorazione.
    2. Diluire CUG in FM 1:50 in una cappa scura con un'esposizione minima alla luce.
    3. Preriscaldare il CUG diluito a 37°C per 3-5 minuti.
14. Quindi, aggiungere 200 μl di CUG diluito a ciascuna provetta FACS appropriata. Per le valvole non designate per avere CUG, aggiungere solo FM (vedi 2.15).
15. A questo punto, dovrebbero esserci cinque categorie di tubi con i seguenti contenuti (non aggiungere PI in questo passaggio):
    1. Wildtype - senza CUG o PI (per la compensazione, vedere i passaggi 3.5-6)
    2. Wildtype - solo con PI (per compensazione)
    3. Wildtype - con CUG e PI (per il controllo contro le cellule Axin2-LacZ)
    4. Axin2-LacZ - solo con CUG (per compensazione)
    5. Axin2-LacZ - con CUG e PI (per l'effettiva selezione cellulare)
    6. Axin2-LacZ - con CUG e PI (per l'analisi degli eventi)
16. Proteggere tutte le provette dalla luce e incubarle in un'incubatrice umidificata a 37°C per 25 minuti.
17. Preparare una soluzione fresca di HEPES + siero fetale bovino (FBS) per arrestare la reazione dopo l'incubazione:
    1. Diluire 400 μl di FBS appena scongelato in 10 ml di HEPES sterile da 10 mM (in PBS) in una provetta Falcon da 15 ml.
    2. Posizionare il tubo sul ghiaccio fino al completamento del 2.16.
18. Aggiungere 1,8 ml di soluzione HEPES ghiacciata a ciascuna provetta FACS sotto una cappa sterile con le luci spente per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.
19. Centrifugare le celle a 1200 giri/min per 5 minuti.
20. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 300 μl FM, raggruppare tutte le aliquote per il campione di selezione (Axin2-LacZ colorato con CUG e PI).
21. Aggiungere PI a ciascuna provetta per ottenere una concentrazione finale di 1 μg/ml.
22. Posizionare le celle sul ghiaccio e proteggerle dalla luce.

3. Citometria a flusso

1. Utilizziamo un BD Aria II dotato di laser a 488 nm, 633 nm e 407 nm. Il rilevamento del CUG è stato effettuato utilizzando il laser viola da 407 nm e il PI utilizzando il laser blu da 488 nm presso la Stanford Shared FACS Facility.
2. È necessario un operatore di citometro a flusso addestrato. Procedere al passaggio successivo dopo aver riscaldato i laser, calibrato i rilevatori del citometro seguendo le istruzioni del produttore e impostato i parametri di smistamento ottimali. Nella nostra esperienza, abbiamo scoperto che l'uso di un ugello da 100 μm ottimizza la vitalità cellulare per gli esperimenti successivi.
3. Sono stati utilizzati i seguenti parametri: soglia a 5.000 eventi, portata inferiore a 3.000 eventi/secondo, dispersione diretta (FSC) a 125 volt e dispersione laterale (SSC) a 250 volt, il canale PE-Cy5 è stato utilizzato per PI e Cascade Blue per CUG.
4. Lavare la camera del citometro con etanolo al 70% e PBS due volte ciascuno in quest'ordine.
5. Iniziare l'analisi con cellule wildtype non colorate (provetta A nel passaggio 2.15). Raccogli 1.000 eventi per determinare la distribuzione delle celle sul grafico FSC rispetto a SSC. Se la dispersione non è desiderata, regolare i parametri FSC e SSC.
6. Eseguire la compensazione utilizzando celle WT (tubo A) non colorate, WT (tubo B) colorate con PI e Axin2-LacZ (tubo D) colorate con CUG. La compensazione consentirà una discriminazione del segnale più accurata tra le diverse lunghezze d'onda del laser.
7. Iniziare l'analisi con cellule colorate con PI e CUG wildtype (provetta C) e impostare i parametri di gating per:
   1. Esclusione dei detriti in base al grafico FSC rispetto a SSC.
   2. Esclusione di doppietti e ciuffi utilizzando il grafico FSC-height rispetto a FSC-area.
   3. Esclusione delle cellule morte in base al grafico dell'area FSC rispetto all'area PE-Cy5.
   4. Imposta il grafico dell'area FSC rispetto all'area blu della cascata con qualsiasi posizionamento del cancello.
8. Successivamente, analizza 10.000 eventi da una provetta di campionamento che contiene Axin2-LacZ PI e cellule colorate con CUG (provetta F).
   1. Tutti i gate impostati utilizzando celle wildtype dovrebbero essere applicati qui.
   2. Utilizzando i grafici per le celle wildtype, creare gate per le celle a cascata di altezza blu inferiori all'1% del numero totale di eventi.
   3. Questi stessi cancelli di Cascade Blue-high ora comprendono circa il 15-20% delle cellule nel campione di Axin2-LacZ, rendendo queste cellule alte Axin2.
   4. Utilizzando il grafico di analisi delle cellule Axin2-LacZ, creare un gate per il 15-20% delle cellule meno fluorogeniche, d'ora in poi le cellule Axin2-low.
9. Sulla base della strategia di gating di cui sopra, suddividere le cellule in provette FACS contenenti 500 μl FM, una provetta per Axin2-high e l'altra per le cellule Axin2-low. Assicurarsi che le provette di raccolta siano in una camera raffreddata a 4°C durante la cernita.
10. Registrare il numero di cellule contate dal citometro a flusso per ogni popolazione.

4. Risultati rappresentativi (vedi Figura 2):

Con il protocollo di cui sopra, in genere recuperiamo il 40-45% di cellule prive di detriti sia dal wildtype che dalle coclee^{Axin2 LacZ/+} (Figure 2A e B), con circa il 70% di esse prive di doppietti (vedi Figure 2A' e B'). La maggior parte delle cellule selezionate sono vitali e non hanno assorbito PI (~95%) (Figure 2A'' e B''). In media, le prime cellule ~20% CUG-positive sono considerate cellule Axin2-LacZ-positive (Figura 2B''') e sono correlate a circa 15.000 cellule Axin2-LacZ-high per 10-12 animali.

L'analisi di riordinamento della citometria a flusso delle cellule ad alto contenuto di Axin2 ha rivelato una purezza superiore al 93% nel canale Cascade Blue. Al fine di confermare ulteriormente l'identità di queste cellule, abbiamo eseguito l'immunocolorazione post-sort di entrambe le cellule Axin2-high e Axin2-low utilizzando anticorpi anti-β-galattosidasi e abbiamo scoperto che le cellule Axin2-high contenevano ~93,4% di cellule β-galattosidasi-positive (più di 1.500 cellule analizzate) e che le cellule Axin2-low contenevano ~4,8% di cellule β-galattosidasi-positive.

Cifre e tabelle:

Figura 1.Paradigma sperimentale. La figura sopra descrive la strategia e le tecniche sperimentali complessive come descritto nella sezione del protocollo. Le coclee di topi wildtype e Axin2^LacZ/+ vengono raccolte e dissociate in singole cellule, che sono state poi trattate con CUG, un substrato fluorescente per la β-galattosidasi. Le cellule alte e basse di Axin2-LacZ sono state quindi separate mediante citometria a flusso. Clicca qui per visualizzare una versione a grandezza naturale di questa immagine.

Figura 2.Strategie di gating. Questa figura illustra le strategie di gating per citometria a flusso utilizzate. A) Le cellule wildtype dissociate che hanno subito lo stesso trattamento delle cellule Axin2-LacZ sono analizzate qui utilizzando un totale di 10.000 eventi. Il primo pannello mostra l'area di dispersione laterale (SSC-A) rispetto all'area di dispersione diretta (FSC-A). Qui, un gruppo distinto di eventi è di dimensioni molto più grandi di quelli più vicini all'asse y. Questi eventi sono designati come "Debris Negative". Il gate successivo, A', analizza le celle "Debris Negative" del pannello A, che rappresentano il 43,8% del numero totale di eventi (vedi tabella sotto). In questo pannello, l'altezza di dispersione diretta (FSC-H) rispetto all'FSC-A viene utilizzata per escludere i doppietti. Sono esclusi gli eventi che si discostano dalla natura lineare prevista del grafico. Questa preparazione produce in genere ~70% di eventi all'interno del gate designato e le celle rimanenti vengono escluse. Nel pannello A'', lo ioduro di propidio (PI) rilevato dal canale PE-Cy5, viene utilizzato per marcare le cellule morte (5,3%). Nel pannello successivo (A'''), il canale blu Cascade viene utilizzato per rilevare il substrato fluorescente CUG. Qui, i cancelli LacZ-high includono meno dell'1% degli eventi totali. B) Le cellule dissociate da topi Axin2-LacZ trattati con CUG e PI sono analizzate qui utilizzando un totale di 10.000 eventi. Qui vengono applicati cancelli identici del pannello A. B' mostra che il 29,5% delle cellule sono escluse come doppiette, mentre B'' dimostra che il 5,4% non è vitale. Le porte iniziali per le celle LacZ-high e -low sono disegnate utilizzando il pannello B''' con LacZ-high inizialmente impostato al 19,7% e LacZ-low al 20,4%. Clicca qui per visualizzare una versione a grandezza naturale di questa immagine.

    Numero dell'evento percentuale un Analisi Wildtype 10.000   A' Detriti negativi 4.381 43,80% A'' Doppietto negativo 3.116 71,10% A''' PI Negativo 2.951 94,70%   LacZ-alto 16 0,54%   LacZ-basso 2.790 94,50% E Analisi di Axin2-LacZ 10.000   B' Detriti negativi 4.218 42,2% B'' Doppietto negativo 2.973 70,50% B''' PI Negativo 2.813 94,6%   LacZ-alto 553 19,70%   LacZ-basso 573 20,40%

Tabella 1. Analisi quantitative delle strategie di gating nella Figura 2.

Discussione

Studi di ricerca indipendenti hanno caratterizzato una limitata capacità rigenerativa all'interno delle coclee neonatali^2,10,12,13. Utilizzando un topo reporter GFP e la citometria a flusso, White e colleghi hanno isolato specifiche cellule cocleari di supporto e hanno scoperto che avevano caratteristiche di cellule progenitrici¹².

È stato dimostrato che la via canonica di Wnt è in grado di marcare popolazioni di cellule staminali/progenitrici in diversi sistemi di organi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra di Petri, polistirolo, sterile Geriner Bio-one 35 x 10 mm	VWR international	82050-540
BD Filtri cellulari per falco, sterili, BD Biosciences, blu, 40 μ m	VWR international	21008-949
Hanks' Soluzione salina bilanciata (HBSS). Soluzione con calcio, magnesio e senza rosso fenolo, sterile	VWR international	45000-456
Cellstar provette per centrifuga, polipropilene, sterile, greiner bio-one, 50 ml	VWR international	82050-346
Cellstar provette per centrifuga, polipropilene, sterile, greiner bio-one, 15 ml	VWR international	82050-278
B-27 Integratore senza siero (50x), liquido	Invitrogen	17504-044
N-2 Integratore (100x), liquido	Invitrogen	17502-048
bFGF, fattore di crescita dei fibroblasti-base umano	Sigma-Aldrich	F0291
IGF-1, fattore di crescita insulino-simile-1 da	Sigma-Aldrich	I8779
EGF, fattore di crescita epidermico umano	Sigma-Aldrich	E9644
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medio/Prosciutto' s F-12 50/50 Miscela: 1X, con L-Glutammina e 15 mM HEPES	VWR international	45000-350
BD Falcon Round-Bottom Tubes, monouso, polistirene, 12x75	VWR international	60819-295
Tripsina, 0,25% (1X) con EDTA 4Na, liquido	Invitrogen	25200-056
ep Dualfilter TIPS 300uL, 960 TIPS	Eppendorf	22491245
Inibitore della tripsina, soia, purificato	Worthington Biochemical	LS003570
BD Falcon 40um Filtri cellulari	BD Biosciences	21008-949
Piastre multipozzetto, Polistirene, Greiner Bio-One, Piastre non trattate, 6 pozzetti	VWR international	82050-846
Marker Gene FACS Blue LacZ beta-Galattosidasi Detection Kit	Marker Gene Technologies	M0255