Un sistema sperimentale per studiare meccanotrasduzione in cellule polmonari fetali

Sommario

Forze meccaniche svolgono un ruolo chiave nello sviluppo del polmone e danno polmonare. Qui, descriviamo un metodo per isolare i roditori le cellule fetali del polmone di tipo II epiteliali e fibroblasti e di esporle alla stimolazione meccanica con un In vitro Sistema.

Abstract

Forze meccaniche generate in utero da ripetitivi respiro, come movimenti e dalla distensione fluida sono fondamentali per lo sviluppo polmonare normale. Una componente chiave dello sviluppo del polmone è la differenziazione delle cellule epiteliali alveolari di tipo II, la principale fonte del surfattante polmonare. Queste cellule partecipano anche l'omeostasi del liquido nel lume alveolare, la difesa ospite, e la riparazione del pregiudizio. Inoltre, cellule parenchimatiche polmonari distali possono essere direttamente esposti al tratto esagerata durante la ventilazione meccanica dopo la nascita. Tuttavia, i precisi meccanismi molecolari e cellulari con cui le cellule polmonari rilevano stimoli meccanici di influenzare lo sviluppo del polmone e per promuovere danno polmonare non sono completamente compresi. Qui, forniamo un metodo semplice e di elevata purezza per isolare cellule di tipo II e fibroblasti dai polmoni fetali roditori. Poi, ci descrivono un sistema in vitro, The Unit Strain Flexcell, per fornire la stimolazione meccanica alle cellule fetali, la simulazione di forze meccaniche insviluppo fetale del polmone o lesioni ai polmoni. Questo sistema sperimentale fornisce un ottimo strumento per indagare i meccanismi molecolari e cellulari in cellule polmonari fetali esposte per allungare. Usando questo approccio, il nostro laboratorio ha identificato diversi recettori e proteine ​​di segnalazione che partecipano in meccanotrasduzione nello sviluppo del polmone fetale e danno polmonare.

Protocollo

1. Rivestimento di piastre con proteine ​​ECM

1. In condizioni sterili, miscelare 120 mg di laminina con 12 ml di freddo sterile 1X PBS per piastra.
2. Prendere BioFlex lastre non trattate e aggiungere 2 ml della soluzione in ogni pozzetto (concentrazione finale di laminina è 2 ug / cm ^2). In alternativa, altre proteine ​​ECM potrebbero essere utilizzati, come collagene-1 [10 pg / cm ^2], fibronectina [5 pg / cm ^2], vitronectina [0,5 mg / cm ^2] o elastina [10 pg / cm ^2]. La tecnica di rivestimento è simile a quanto descritto per la laminina-rivestimento. Assicurarsi che i pozzetti sono completamente....

Discussione

In questo manoscritto, si descrive un metodo per isolare le cellule fetali di tipo II epiteliali e fibroblasti e di esporle alla stimolazione meccanica con l'apparecchiatura di Strain Flexcell. Abbiamo utilizzato questa tecnica per valutare la differenziazione delle cellule epiteliali ^1,2 e di studiare recettore e vie di segnalazione attivate da tratto ^3-9. Inoltre, questo metodo può anche essere usato per studiare le risposte delle cellule indotte da lesioni meccaniche ^10,11. La pro.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	Sigma-Aldrich	D5648
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Collagenasi 1	Sigma-Aldrich	C0130
Collagenasi 1A	Sigma-Aldrich	C9891
Serum di pollo	Sigma-Aldrich	C5405
Bicchieri per setacciatura	Sigma-Aldrich	CD1-1KT
Filtri per siringa	Fisher Scientific	09-754-25
Maglia in nylon da 100 micron	Small Parts, Inc.	CMN-100-D
Maglia da 30 micron	Small Parts, Inc.	CMN-30-D
Maglia da 15 micron	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX15
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020
Collagene-1	Collagen Biomed	PC0701
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F1141
Vitronettina	Sigma-Aldrich	V-0132
Elastina	Sigma-Aldrich	E-6402
Piastra Bioflex	Flexcell International	BF-3001U	Non rivestita
Unità di stiramento Flexcell	Flexcell International	FX-5000