Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Sommario

Processi cellulari come la migrazione delle cellule sono stati tradizionalmente studiati su due dimensioni, superfici in plastica rigida. Questo rapporto descrive una tecnica per la visualizzazione diretta di localizzazione delle proteine ​​e l'analisi dinamica della proteina in cellule di migrare in modo più fisiologicamente rilevanti, matrice tridimensionale.

Abstract

Tradizionalmente, la migrazione delle cellule è stato studiato su due dimensioni, superfici in plastica rigida. Tuttavia, durante importanti processi biologici come la guarigione delle ferite, la rigenerazione dei tessuti, e le metastasi del cancro, le cellule devono navigare attraverso complesse, tridimensionali tessuto extracellulare. Per meglio comprendere i meccanismi alla base di questi processi biologici, è importante esaminare il ruolo delle proteine ​​responsabili per la guida migrazione cellulare. Qui, delineare un protocollo per studiare i meccanismi della migrazione cellulare utilizzando la linea delle cellule epiteliali (MDCK) e una tridimensionale, fibroso, auto-polimerizzazione della matrice come sistema modello. Questa matrice extracellulare otticamente chiaro è facilmente riconducibile a vivere a cellule studi di imaging e meglio imita il fisiologico, l'ambiente dei tessuti molli. Questa relazione dimostra una tecnica per la visualizzazione diretta di localizzazione delle proteine ​​e la dinamica, e la deformazione del circostante matrice tridimensionale.

Esameminazione della localizzazione delle proteine ​​e delle dinamiche durante i processi cellulari fornisce informazioni chiave in funzioni delle proteine. Geneticamente codificato tag fluorescenti di fornire un metodo unico per osservare la localizzazione delle proteine ​​e la dinamica. Utilizzando questa tecnica, possiamo analizzare l'accumulo subcellulare di chiave, la forza che generano componenti del citoscheletro in tempo reale come le manovre cellula attraverso la matrice. Inoltre, utilizzando più tag fluorescenti con diverse lunghezze d'onda, possiamo esaminare la localizzazione delle proteine ​​contemporaneamente, permettendoci così di prova, ad esempio, se diverse proteine ​​hanno ruoli simili o divergenti. Inoltre, la dinamica delle proteine ​​fluorescenti tag può essere quantificata l'utilizzo di recupero dopo photobleaching fluorescenti (FRAP) analisi. Questo test misura la mobilità delle proteine ​​e come stabilmente le proteine ​​sono legati alla rete del citoscheletro.

Grazie alla combinazione di live-cellulare imaging con trattamento di inibitori della funzione della proteina,possiamo esaminare in tempo reale i cambiamenti nella distribuzione delle proteine ​​e della morfologia delle cellule migrano. Inoltre, abbiamo anche combinare live-cell imaging con l'uso di particelle traccianti fluorescenti incorporate nella matrice di visualizzare la matrice di deformazione durante la migrazione cellulare. Quindi, possiamo visualizzare come una cellula migrazione distribuisce la forza che generano le proteine, e dove le forze di trazione sono esercitate alla matrice circostante. Attraverso queste tecniche, siamo in grado di acquisire una conoscenza diretta dei ruoli delle proteine ​​specifiche e il loro contributo ai meccanismi della migrazione cellulare.

Protocollo

1. Generazione di linee cellulari stabili (per esempio cellule MDCK)

1. Cellule di germi a 80-90% confluenza in un piatto p35. Non lasciate che le cellule forma al 100% monostrato confluenti, che ridurrà l'efficienza di trasfezione.
2. Trasfezione delle cellule con il plasmide di interesse utilizzando Lipofectamine 2000. Ottimizzare le condizioni di transfezione utilizzando il protocollo del produttore.
3. Il giorno dopo, il passaggio delle cellule in due p150 piastre Petri. Il grande piatto è consigliato per permettere distanza sufficiente tra le colonie stabili.
4. Il giorno dopo, cambiare i media e aggiungere 500 mg / ml di G418 per ogni piatto. La concentrazione G418 dovrebbe essere ottimizzato per le linee di cellule singole.
5. Sostituzione dei supporti a giorni alterni per circa 2 settimane. Dopo 2 settimane, G418 resistenti colonie dovrebbe iniziare a formare, e sarà visibile ad occhio nudo.
6. Utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza, identificare le colonie GFP positive. Segna queste colonie sulla piastra con una penna Sharpie.
7. Per selettivamente trypsinize le colonie dalla piastra di coltura tissutale, aspirare i mezzi di comunicazione, e lavare le cellule due volte con PBS o soluzione tripsina. Al secondo lavaggio, non aspirare fuori tutta la soluzione. Lascia un sottile strato di liquido sul fondo del piatto per evitare che le cellule si asciughi.
8. Per ogni colonia segnato: utilizzare un batuffolo di cotone sterile per pulire il più possibile intorno al bordo della colonia. Questo creerà un 'isola di zona umida contenente la colonia di cellule. Pipettare 10 ml di tripsina sulla colonia. Ripetere l'operazione per ogni colonia, e procedere rapidamente per evitare l'essiccamento. Un ricercatore esperto di solito può scegliere ~ 12 colonie per piastra p150.
9. Incubare piastra a 37 ° C per 5-10 minuti fino a quando le cellule si staccano dal piatto e appaiono rotondo.
10. Per ogni colonia: Pipettare 10 ml di tripsina sulla colonia, e la pipetta su e giù per un paio di volte per staccare le cellule dalla piastra. Pipettare quindi tutte le cellule dalla colonia in un singolo pozzo in un piatto ben 24.
11. Dopo colonie stabili sono cresciuti, espressione di proteine ​​di ogni colonia è analizzata utilizzando standard di western blot e immunofluorescenza. Espandere queste linee cellulari per ulteriori analisi.

2. Modifica della superficie di piatto fondo di vetro per la rilegatura collagene ottimale (opzionale)

1. Per silanize il vetro, pipetta 300 ul del 2% 3-Aminopropyltrimethoxysilane soluzione sulla parte in vetro di ogni piatto p35 con apertura 10 mm. Vedere la Figura 1 per la silanizzazione e cross-linking schematico. 3-Aminopropyltrimethoxysilane viene diluito in acqua filtrata.
2. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
3. Aspirare il 3-Aminopropyltrimethoxysilane soluzione e lavare con acqua filtrata tre volte per 10 minuti ciascuno.
4. Aspirare i piatti l'acqua e posto sulla piastra calda impostata a 50 ° C per 1,5 ore. Cime luogo di piatti leggermente fuori il piatto in modo che l'umidità nel piatto può sfuggire.
5. Togliere dal fuoco e piatti permettono di cool.
6. Pipettare 300 ml di soluzione di glutaraldeide al 2% sulla parte in vetro di ogni piatto. La glutaraldeide viene diluito in PBS.
7. Incubare per 1 ora.
8. Aspirare la soluzione di glutaraldeide e lavare i piatti con PBS per tre volte per 10 minuti ciascuno.
9. Sterilizzare i piatti da esposizione a luce UV per 1 ora. I piatti silanizzata possono essere conservati a temperatura ambiente.

3. Preparazione del gel di collagene 3D con le particelle traccianti

1. Lavare le particelle traccianti fluorescenti riducendo la velocità 100 l di brodo di particelle traccianti ⁽¹⁰ 10 particelle / ml) in una centrifuga a 15.000 rpm per 5 minuti, aspirare liquido fuori, e aggiungere 500 ml di media. Ripetere 5 volte. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le particelle in 30 l di media.
2. Trypsinize cellule GFP che esprimono come al solito.
3. Risospendere il pellet cellulare di circa 2 x 10 ⁶ cellule / ml.
4. Pipettare 240 ml di terreni di crescita in una provetta Eppendorf.
5. Aggiungere 12,6 ml di Hepes 1M, 20 ml di acqua filtrata, 50 ml di soluzione di cellule, poi 10 ml di particelle fluorescenti.
6. Infine, aggiungete 167 ml di derma collagene bovino soluzione (per ottenere una concentrazione di lavoro di 1 mg / ml).
7. Mescolare accuratamente una soluzione, poi pipetta 80 ml di soluzione sulla parte in vetro del piatto silanizzata fondo di vetro.
8. Piatto posto in incubatrice e consentire al gel di polimerizzare a 37 ° C per 30 minuti. Vedi Figura 1A per il gel di collagene tipica in un piatto fondo di vetro p35.
9. Aggiungere 2 ml di terreni di crescita con attenzione per ogni piatto.

4. Procedura per la time-lapse di acquisizione di immagini

1. Accendere il controllo della temperatura della custodia microscopio e lasciare la camera di portata equilibrare a una temperatura allo stato stazionario a 37 ° C. Vedere la Figura 2 per un esempio di live-cell sistema di imaging.
2. Modificare i media ai nuovi media integrati con 25 mM Hepes a mantenere un pH neutro. PerDIC immagini, scambio la parte superiore del piatto con uno che ha un piano in vetro. Utilizzando una sottile striscia di parafilm, coprire il lato del piatto per evitare l'evaporazione dei media.
3. Per un obiettivo ad immersione olio, mettere una goccia di liquido ad immersione sull'obiettivo.
4. Posizionare il gel di collagene contenente piatto sul palco microscopio, e assicurarsi il piatto entra in contatto con il liquido ad immersione.
5. Messa a fuoco il campione e ricerca per le cellule di interesse per l'immagine. Per ridurre al minimo deriva fase, permettono piatto di stabilirsi per circa 45 minuti prima di iniziare una cattura a lungo.
6. Specificare i parametri di acquisizione delle immagini. Minimizzare l'esposizione a laser, che potrebbe danneggiare le cellule, modulando la potenza del laser, il tempo di esposizione, la frequenza e la durata del tempo di acquisizione. I parametri di effettiva varia a seconda del sistema di microscopio e tipo di cellula.
7. Durante il time-lapse di acquisizione, un inibitore può essere aggiunto. Per l'esperimento Inoltre inibitore, non sigillare il piatto con parafilm.
   1. PrepHepes sono integrati con i media farmaco ad una concentrazione di lavoro desiderato.
   2. Quando si è pronti per aggiungere farmaco ai media, mettere in pausa la cattura delle immagini, e rimuovere con attenzione la parte superiore piatto senza disturbare il piatto.
   3. Aspirare i mezzi di comunicazione nel piatto, e pipetta il farmaco contenente mezzi di comunicazione nel piatto. Poi, con cura sostituire il top piatto.
   4. Il campione può essere out-of-focus per l'aggiunta dei nuovi media, regolare la messa a fuoco.
   5. Riavviare la cattura, quindi monitorare la cattura per i prossimi 30 minuti, e regolare la messa a fuoco, se necessario. Vedi Figura 4 per un esempio di esperimento di droga oltre.

5. FRAP procedura e analisi

1. Il setup FRAP varia tra i sistemi, seguite le istruzioni del produttore.
2. Impostare i parametri per il live-cell imaging.
3. Impostare i parametri per photobleaching. Usare il potere sufficiente laser per photobleach il segnale fluorescente senza danneggiare la cellula. Prova questi parameters sulle cellule pratica.
4. Avviare la cattura delle immagini, e attendere almeno 5 fotogrammi della cattura dell'immagine prima photobleaching la regione di interesse.
5. Continua la cattura, e il tempo di recupero dovrebbe essere sufficiente a catturare il pieno recupero di fluorescenza. Vedere la Figura 5 per un esempio di esperimento di FRAP.
6. Analizzare il recupero di fluorescenza, misurando l'intensità media di fluorescenza nell'area fotodecolorate (prima e dopo photobleaching) nel tempo. Utilizzando un software di analisi statistica (ad esempio Excel), montare la curva di recupero per l'equazione esponenziale: I = _f ^(1-e-kt), dove I è l'intensità, I _f è l'intensità finale, t è il tempo, e τ _½ è il tempo necessario per l'intensità per raggiungere la metà del valore finale: τ _½ = ln (2) / k. Il primo tempo è una misura del tasso di mobilità della proteina.
7. Ottenere i parametri, primo tempo e l'intensità finale del-curva esponenziale. Calcola °e frazione mobili prendendo il rapporto tra la finale di iniziale intensità di fluorescenza.

6. Rappresentante Risultati

Un esempio di live-imaging di cellule sane cellule epiteliali all'interno della matrice è mostrata in Figura 3. Le cellule sane presentano una superficie liscia, membrana continua, e nucleo distinto, mentre le cellule malsane spesso hanno una membrana interrotto, e un numero eccessivo di vacuoli. In una matrice 3D, singole cellule epiteliali migrano ^1, e nel corso di diversi giorni, le cellule epiteliali forma tridimensionale, sferico, multi-cellulare cisti all'interno della matrice ^2. Le cellule sono altamente dinamici, e migrano all'interno della cisti (Figura 3). La deformazione della matrice come risultato delle forze di trazione esercitata dalla migrazione delle cellule viene analizzato attraverso lo spostamento delle particelle traccianti incorporati nella matrice circostante (Figura 4). I movimenti delle particelle traccianti vengono visualizzati come immagine di proiezione massima di diversopunti tempo ORL, e ogni punto il tempo è pseudo-colore per indicare il tempo (Figura 4B). In alternativa, le immagini di una particella tracciante singolo vengono visualizzati come un montaggio per mostrare il movimento della particella tracciante nel tempo (Figura 4C). Tutte le analisi delle immagini è stata effettuata usando ImageJ. Queste valutazioni qualitative di deformazione della matrice, e quindi le forze esercitate dalle cellule migrano, sono utili prima approssimazione della distribuzione forza di trazione. La stima quantitativa delle forze di trazione esercitata dalla migrazione delle cellule in 3D va oltre lo scopo di questo protocollo ed è descritto altrove ^3,4.

Una ripresa tipica fluorescenza dopo photobleaching esperimento è mostrato in Figura 5. La regione di interesse deve essere fotodecolorate utilizzando le impostazioni ottimizzate per laser in modo che l'intensità di fluorescenza è visibilmente diminuito rispetto ai livelli di fondo (per massimizzare il rapporto segnale-rumore), mantenendo le cellule sane e senza danni. L'impostazione ottimale deve be determinati empiricamente come ogni impostazione FRAP è diverso (per esempio, FRAP utilizzando scansione laser confocale sistema).

L'esposizione e il tempo-intervallo di post-FRAP acquisizione delle immagini deve essere attentamente controllata per evitare photobleaching sfondo. L'utilizzo di energia laser inferiore, breve tempo di esposizione, e l'uso della macchina fotografica sensibile e di alta ottiche efficienti è essenziale per l'imaging di alta qualità FRAP. Se la fluorescenza sbiancamento durante l'acquisizione delle immagini è notevole, questa dissolvenza sfondo deve essere quantificato e normalizzato compreso tra il recupero osservato intensità di fluorescenza. A causa della natura 3D dell'ambiente, la componente z di recupero intensità di fluorescenza può diventare significativo. Pertanto, è importante definire un volume fotodecolorate prendendo pre e post-stack di immagini 3D di regione fotodecolorate. Ulteriori analisi e modellazione di recupero fluorescenza è discusso altrove ^5,6.

La combinazione unica di vivere a cellule di imaging techniques: GFP per seguire la dinamica delle proteine ​​del citoscheletro, fluorescenza rossa particelle traccianti per monitorare la deformazione della matrice, e l'aggiunta di inibitori, possono essere usati contemporaneamente per l'analisi della dinamica delle proteine, la forza di trazione e percorsi molecolari.

Figura 1. Preparazione del gel di collagene. A) polimerizzata matrice di collagene su un fondo di vetro piatto. Il colore rosa del gel è dovuto a particelle fluorescenti incorporato. B) Procedura per trattare i piatti in vetro basso per reticolare il gel di collagene alla superficie del vetro. In primo luogo, il piatto fondo di vetro è trattato con 3-Aminopropyltrimethoxysilane soluzione, soluzione di glutaraldeide che reticola la matrice di collagene per il vetro.

Figura 2. Schema di confocale / FRAP configurazione microscopio. Il confocalemicroscopio si basa su un AxioObserver Zeiss con una macchina fotografica HQ CoolSnap II CCD e completamente automatizzato da Slidebook software (Intelligent Imaging Innovations). L'unità confocale è progettato su misura e basate su unità disco Yokogawa filatura CSU10 e due laser a stato solido (488 nm con 50 mW e 561 nm con 40 mW) con Acusto-filtro ottico sintonizzabile (AOTF) per consentire millisecondi il passaggio tra due laser. I filtri di emissione sono nm nm 525/50 e 620/60 (# 118661 e # 118085, Tecnologia Chroma) e specchio dicroico è 488-568 banda Brightline Dual (Semrock). Gli obiettivi sono una lunga distanza di lavoro 40x C-Apochromat obiettivo con NA 1.1 e distanza di lavoro di 0,62 millimetri, e un 63x Plan-Apochromat obiettivo con NA 1,4 e una distanza di lavoro di 0,19 mm. Il microscopio comprende anche un sistema di fotoablazione FRAP che consiste in una fibra di pompaggio ottico dye laser, un raggio del computer controllato posizione e l'intensità, e una limitata dimensione dello spot di diffrazione. Inoltre, il microscopio è dotato diuno stadio XY motorizzato che include 0,1 micron encoder lineari su ogni asse. Durante il time-lapse imaging, la temperatura ambientale è mantenuto da una camera di costume microscopio progettato e un riscaldatore con controllo della temperatura feedback. Per isolare il rumore e le vibrazioni, il sistema intero microscopio è su un tavolo senza vibrazioni.

Figura 3. Dal vivo imaging cellulare delle cellule epiteliali che esprimono GFP-actina. Queste cellule formano una cisti dopo 4 giorni di cultura in una matrice di collagene 3D. Alcune cellule si muovono lungo la superficie della cisti (freccia gialla), mentre altri migrano all'interno l'interno della cisti (freccia rossa). Scala bar 10 micron, il tempo in ore.

Figura 4. L'effetto di inibizione della Rho-chinasi sulla forza di trazione. A) DIC immagine di una cellula migrazione MDCK esprimere GFP tag marcatore nucleare. L'immagine è stata presa immediatamente prima del trattamento della Rho-chinasi inibitore Y-27632. Scala bar 10 micron. B) lo spostamento delle particelle risultanti dalla somma di Y-27632. Le posizioni delle particelle in vari momenti (0 - 52 min) sono stati pseudo-colore secondo la scala di intensità, poi proiettata su una singola immagine. La regione bianco è il nucleo GFP positive nelle cellule migrano. Scala bar 10 micron. Tempo in minuti. C) Il movimento delle particelle al bordo d'uscita della cella (vedi freccia in B). Asterisco indica l'ultimo fotogramma catturato prima di Y-Oltre 27.632. La particella tracciante spostato verso e lontano dal bordo di uscita della cellula migrazione prima e dopo l'aggiunta di Y-27632, rispettivamente. Scala di misura 1 micron.

Figura 5. FRAP analisi di actina-GFP che esprimono migrazione delle cellule in una matrice tridimensionale. A) le immagini Timelapse della GFP-actina esprimendo cellulari di prima e dopo la photobleaching. Una piccola regione della GFP-actina accumulato nella parte posteriore cella era fotodecolorate (freccia rossa) a timepoint 0. Tempo in secondi, scala bar 5 micron. B) L'intensità media di fluorescenza della regione fotodecolorate (linea continua), e la misura esponenziale della ripresa fluorescenza (cerchi) tracciati nel tempo. L'intensità della fluorescenza è stata normalizzata al valore iniziale prima photobleaching.

Discussione

Qui si descrive un metodo per l'utilizzo live-cell imaging per studiare i meccanismi di migrazione delle cellule in una matrice tridimensionale. Il successo di questa tecnica dipende da ottenere "buoni" cloni che esprimono stabilmente GFP-tagged proteine. Il basso livello di proteine ​​GFP richiede un'esposizione eccesso di eccitazione che compromette la salute delle cellule, mentre il livello troppo alto GFP avrà effetti collaterali indesiderati sulla cellula. Così, la scelta vettore per trasfettare g...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Collagene, bovino, tipo I	BD Biosciences	354231	Magazzino è di circa 3 mg / ml
3-aminopropyltrimethoxysilane	Sigma Aldrich	281778	Diluire in acqua
glutaraldeide	Sigma Aldrich	340855	Diluire in PBS
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
Fluospheres polistirolo microsfere di 1 micron, fluorescenza rossa (580/605)	Invitrogen	F13083
Geneticin (G418)	Invitrogen	11811-031
Cultura dei media componenti:
DMEM	Invitrogen	31600-034
Siero bovino fetale	Atlanta Biologicals	S115500
Penicillina / streptomicina	Invitrogen	15140-122
Kanamicina	Invitrogen	15160-054