Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Sommario

Processi cellulari come la migrazione delle cellule sono stati tradizionalmente studiati su due dimensioni, superfici in plastica rigida. Questo rapporto descrive una tecnica per la visualizzazione diretta di localizzazione delle proteine ​​e l'analisi dinamica della proteina in cellule di migrare in modo più fisiologicamente rilevanti, matrice tridimensionale.

Abstract

Tradizionalmente, la migrazione delle cellule è stato studiato su due dimensioni, superfici in plastica rigida. Tuttavia, durante importanti processi biologici come la guarigione delle ferite, la rigenerazione dei tessuti, e le metastasi del cancro, le cellule devono navigare attraverso complesse, tridimensionali tessuto extracellulare. Per meglio comprendere i meccanismi alla base di questi processi biologici, è importante esaminare il ruolo delle proteine ​​responsabili per la guida migrazione cellulare. Qui, delineare un protocollo per studiare i meccanismi della migrazione cellulare utilizzando la linea delle cellule epiteliali (MDCK) e una tridimensionale, fibroso, auto-polimerizzazione della matrice come sistema modello. Questa matrice extracellulare otticamente chiaro è facilmente riconducibile a vivere a cellule studi di imaging e meglio imita il fisiologico, l'ambiente dei tessuti molli. Questa relazione dimostra una tecnica per la visualizzazione diretta di localizzazione delle proteine ​​e la dinamica, e la deformazione del circostante matrice tridimensionale.

Esameminazione della localizzazione delle proteine ​​e delle dinamiche durante i processi cellulari fornisce informazioni chiave in funzioni delle proteine. Geneticamente codificato tag fluorescenti di fornire un metodo unico per osservare la localizzazione delle proteine ​​e la dinamica. Utilizzando questa tecnica, possiamo analizzare l'accumulo subcellulare di chiave, la forza che generano componenti del citoscheletro in tempo reale come le manovre cellula attraverso la matrice. Inoltre, utilizzando più tag fluorescenti con diverse lunghezze d'onda, possiamo esaminare la localizzazione delle proteine ​​contemporaneamente, permettendoci così di prova, ad esempio, se diverse proteine ​​hanno ruoli simili o divergenti. Inoltre, la dinamica delle proteine ​​fluorescenti tag può essere quantificata l'utilizzo di recupero dopo photobleaching fluorescenti (FRAP) analisi. Questo test misura la mobilità delle proteine ​​e come stabilmente le proteine ​​sono legati alla rete del citoscheletro.

Grazie alla combinazione di live-cellulare imaging con trattamento di inibitori della funzione della proteina,possiamo esaminare in tempo reale i cambiamenti nella distribuzione delle proteine ​​e della morfologia delle cellule migrano. Inoltre, abbiamo anche combinare live-cell imaging con l'uso di particelle traccianti fluorescenti incorporate nella matrice di visualizzare la matrice di deformazione durante la migrazione cellulare. Quindi, possiamo visualizzare come una cellula migrazione distribuisce la forza che generano le proteine, e dove le forze di trazione sono esercitate alla matrice circostante. Attraverso queste tecniche, siamo in grado di acquisire una conoscenza diretta dei ruoli delle proteine ​​specifiche e il loro contributo ai meccanismi della migrazione cellulare.

Protocollo

1. Generazione di linee cellulari stabili (per esempio cellule MDCK)

1. Cellule di germi a 80-90% confluenza in un piatto p35. Non lasciate che le cellule forma al 100% monostrato confluenti, che ridurrà l'efficienza di trasfezione.
2. Trasfezione delle cellule con il plasmide di interesse utilizzando Lipofectamine 2000. Ottimizzare le condizioni di transfezione utilizzando il protocollo del produttore.
3. Il giorno dopo, il passaggio delle cellule in due p150 piastre Petri. Il grande piatto è consigliato per permettere distanza sufficiente tra le colonie stabili.
4. Il giorno dopo, cambiare i media e aggiungere 500 mg / ml di G418 pe....

Discussione

Qui si descrive un metodo per l'utilizzo live-cell imaging per studiare i meccanismi di migrazione delle cellule in una matrice tridimensionale. Il successo di questa tecnica dipende da ottenere "buoni" cloni che esprimono stabilmente GFP-tagged proteine. Il basso livello di proteine ​​GFP richiede un'esposizione eccesso di eccitazione che compromette la salute delle cellule, mentre il livello troppo alto GFP avrà effetti collaterali indesiderati sulla cellula. Così, la scelta vettore per trasfettare g.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Collagene, bovino, tipo I	BD Biosciences	354231	Magazzino è di circa 3 mg / ml
3-aminopropyltrimethoxysilane	Sigma Aldrich	281778	Diluire in acqua
glutaraldeide	Sigma Aldrich	340855	Diluire in PBS
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
Fluospheres polistirolo microsfere di 1 micron, fluorescenza rossa (580/605)	Invitrogen	F13083
Geneticin (G418)	Invitrogen	11811-031
Cultura dei media componenti:
DMEM	Invitrogen	31600-034
Siero bovino fetale	Atlanta Biologicals	S115500
Penicillina / streptomicina	Invitrogen	15140-122
Kanamicina	Invitrogen	15160-054