Articolo metodologico

Analisi della migrazione cresta neurale e la differenziazione delle specie da Cross-trapianto

DOI:

10.3791/3622

⸱

7 febbraio 2012

 , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University

In questo articolo

Sommario

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Un approccio per l'analisi della migrazione e il destino finale di aviaria cellule della cresta neurale a quaglie-chick embrioni chimera è descritta. Questo metodo è una tecnica semplice e diretto per il tracciamento cellule della cresta neurale durante la migrazione e la differenziazione che sono altrimenti difficili da distinguere all'interno di un embrione di pollo non manipolata.

Abstract

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Embrioni di uccelli fornire una piattaforma unica per studiare molti processi vertebrati sviluppo, a causa della facile accesso degli embrioni all'interno dell'uovo. Chimerici embrioni di uccelli, in cui è trapianto di tessuto donatore quaglie in un embrione di pollo in ovo, combinano la potenza di etichettatura indelebile genetica di popolazioni cellulari con la facilità di manipolazione presentata dalla embrione aviaria.

Quail-pulcino chimere sono uno strumento classico per il tracciamento migratori cellule della cresta neurale (CNC) 1-3. CNC sono una popolazione transitoria migratoria delle cellule nell'embrione, che sono originari della regione dorsale del 4 in via di sviluppo del tubo neurale. Sono sottoposte a uno di transizione epitelio mesenchimale e successivamente migrare verso altre regioni dell'embrione, dove si differenziano in vari tipi cellulari tra cui la cartilagine 5-13, 11,14-20 melanociti, neuroni e glia 21-32. I CNC sono multipotenti, e il loro destino finale è influenzato da 1) la regione del tubo neurale in cui hanno origine lungo l'asse rostro-caudale dell'embrione 11,33-37, 2) i segnali provenienti da cellule vicine mentre migrano 38-44, e 3) il microambiente della loro definitiva destinazione all'interno dell'embrione 45,46. Tracing queste cellule dal loro punto di origine al tubo neurale, alla loro posizione finale e il destino all'interno dell'embrione, fornisce informazioni importanti sui processi evolutivi che regolano patterning e l'organogenesi.

Il trapianto di regioni complementari del tubo neurale del donatore (omotopi innesto) o di diverse regioni del tubo neurale del donatore (trapianto eterotopico) può rivelare differenze di pre-specifiche della NCC lungo l'asse rostro-caudale 2,47. Questa tecnica può essere ulteriormente adattata per trapiantare un compartimento unilaterale del tubo neurale, in modo tale che un lato è derivato da tessuto donatore, e resti lato controlaterale imperturbato nell'embrione ospite, yiElding un controllo interno all'interno del campione stesso 2,47. Può anche essere adattato per il trapianto di segmenti del cervello in embrioni successive, dopo HH10, quando il tubo anteriore neurale è chiuso 47.

Qui riportiamo le tecniche per la generazione di quaglia-chick chimere Con il trapianto del tubo neurale, che consentono di rintracciare CNC migratori provenienti da un segmento discreta del tubo neurale. Specie-specifica etichettatura dei donatori cellule derivate con la quaglia anticorpo specifico QCPN 48-56 consente al ricercatore di distinguere donatore e cellule ospiti al punto finale sperimentale. Questa tecnica è molto semplice, poco costoso, e ha molte applicazioni, tra cui il destino-mapping, linea cellulare l'analisi e l'individuazione pre-patterning eventi lungo l'asse rostro-caudale 45. A causa della facilità di accesso al embrione aviaria, la quaglia-pulcino tecnica innesto può essere combinato con altre manipolazioni, inclusi ma non limitati a ablazione lente 40, l'iniezione di molecole inibitrici 57,58 o manipolazione genetica mediante elettroporazione di plasmidi di espressione 59-61, per identificare la risposta di particolari flussi migratori di CNC alle perturbazioni nel programma di sviluppo dell'embrione. Inoltre, questa tecnica innesto può anche essere usato per generare altri embrioni interspecifiche chimerici come quaglia anatra chimere per studiare contributo al NCC morfogenesi craniofacciale, o mouse-pulcino chimere di combinare la potenza di topo genetica con la facilità di manipolazione dell'embrione aviaria 62.

Protocollo

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1. Incubare pulcino e uova di quaglia allo stadio desiderato

Per HH9 gli embrioni, i tempi di incubazione tipici variano da 29-33 ore a 38 ° C. 63

  1. Lavare i detriti dalle uova con acqua tiepida.
  2. Disporre uova di gallina sul vassoio orizzontale. Contrassegnare il lato rivolto verso l'alto con matita, questo corrisponde alla regione in cui l'embrione viene localizzato. Incubare le uova di quaglia fine smussata up.
  3. Luogo in 38 ° C incubatore umidificato. Accendere funzione dondolo.

2. Preparare le uova per finestre e dissezione

  1. Rimuovere le uova da incubat....

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Discussione

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L'innesto di quaglia tubo neurale in embrioni di pollo di accoglienza qui descritto è una tecnica semplice e poco costoso per il tracciamento sottopopolazioni specifiche di migrazione NCC provenienti da diverse regioni lungo l'asse rostro-caudale 21,67-69. Questa tecnica sfrutta la facilità di accesso alle embrioni di uccelli (rispetto a embrioni mammiferi) e possono essere combinati con altre tecniche, come l'ablazione del tessuto, l'iniezione di molecole inibitrici, manipolazione genetica o .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano i membri del laboratorio Lwigale per la critica del manoscritto. SLG è supportato da una Ruth L. Kirschstein NRSA Fellowship dal National Eye Institute (F32 EY02167301). PYL è supportato dal National Eye Institute (EY018050).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagente Azienda Numero di catalogo
Chick uova Various - usiamo Texas A & M University Poultry Science Department, TX.
Uova di quaglia Various - usiamo Egg Ozarks Company, MO.
Egg incubatore (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w / Umidità 110-120 Volt AC) www.poultrysupply.com 1502
Dumont AA pinze, Inox con verniciatura epossidica Strumenti di Scienza Fine 11210-10
Nastro adesivo Qualsiasi negozio di forniture per ufficio
Iris curvo pinza Strumenti di Scienza Fine 11065-07
Iondia inchiostro Qualsiasi negozio di forniture per l'arte
Pen / Strep (penicillina, streptomicina) Soluzione VWR International 101447-068
Cancella nastro di imballaggio Qualsiasi negozio di forniture per ufficio
Needle apparecchi tirando Narashige, Giappone PE-21
Aghi di vetro tirato, fatto 1,5-1,8 x 100mm tubo di vetro borosilicato capillare Kimble chase 34500 99
Tirato pipetta di vetro, realizzata da 5 ¾ "pipetta Pasteur Fisher Scientific 13-678-6A
Apparecchi Mouth pipetta (tubo aspiratore per il montaggio calibrato pipetta microcapillare) Sigma-Aldrich A5177-52A
Dumont # 5 pinze Strumenti di Scienza Fine 11251-30
Bottegsten filo, diametro 0,1 millimetri VWR International AA10404-H2
Porta aghi (nichelato titolare pin) Strumenti di Scienza Fine 26018-17
QCPN antisiero Developmental Studies ibridomi Bank, University of Iowa QCPN
Alexa Fluor anticorpo secondario (per esempio, Alexa Fluor 594 capra anti-topo IgG1) Invitrogen A21125
Soluzione di Ringer (2L):
  • 14.4g NaCl
  • 0.34g CaCl 2
  • 0.74g KCl
  • 0.230g Na 2 HPO 4
  • 0,04 g KH 2 PO 4
  • ddh 2 O a 2L
  • Filtro e autoclave
Tutti i reagenti da Fisher Scientific
  • 7647-14-5
  • 10043-52-4
  • 7447-40-7
  • 7558-79-4
  • 7778-77-0

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Le Douarin, G., Renaud, D. Morphologic and physiologic study of the differentiation in vitro of quail embryo precardial mesoderm. Bull. Biol. Fr. Belg. 103 (3), 453-468 (1969).
  2. Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods. Mol. Biol.

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Chimera di pulcino di quagliatrapianto del tubo neuralemarcatura con anticorpo QCPNmicroscopia a immunofluorescenzatrapianto omotopicotrapianto eterotopicoasse rostro caudaleaccesso all embrione aviariotracciamento della linea cellulare

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