High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell'influenza

Summary

Questo metodo descrive l'utilizzo di Infrared sistema colorante di imaging based per il rilevamento di H1N1 in bronchioalveolar lavaggio (BAL) fluido di topi infettati ad una sensibilità elevata. Questa metodologia può essere eseguita in uno 96 - o 384-bene piastra, richiede <10 volume pl di materiale di prova e ha il potenziale per lo screening concomitante di agenti patogeni multipli.

Abstract

Il virus influenzale è un patogeno respiratorio che provoca un elevato livello di morbilità e mortalità ogni anno in più parti del mondo. Pertanto, la diagnosi precisa del ceppo infettante e rapida high-throughput screening di un gran numero di campioni clinici è fondamentale per controllare la diffusione delle infezioni pandemiche. Attuali diagnosi cliniche di infezioni influenzali si basano su test sierologici, reazione a catena della polimerasi, immunofluorescenza diretta del campione e la cultura delle cellule ^1,2.

Qui, segnaliamo lo sviluppo di una nuova tecnica diagnostica utilizzata per rilevare virus influenzali vivi. Abbiamo usato il mouse adattato umana A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus ³ per testare l'efficacia di questa tecnica utilizzando cellule MDCK ^4. Cellule MDCK (10 ⁴ o 5 x 10 ³ per pozzetto) sono state coltivate in 96 - o piastre da 384 pozzetti, infettati con PR8 e proteine ​​virali sono stati rilevati utilizzando anti-M2 seguita da uno IR colorante-coniugato secanticorpale secondaria. M2 ⁵ e emoagglutinina ¹ sono due proteine ​​marker principali usati in molti diversi saggi diagnostici. Che impiegano anticorpi secondari IR-dye-coniugati minimizzato l'autofluorescenza associata ad altri coloranti fluorescenti. L'uso di anti-M2 anticorpo ci ha permesso di utilizzare l'antigene-specifica intensità di fluorescenza come una metrica diretta di quantità virale. Per enumerare l'intensità di fluorescenza, abbiamo usato il LI-COR Odyssey scanner basato su IR. Questo sistema utilizza due canali laser basati su rilevamenti a raggi infrarossi per identificare fluorofori e differenziarli dal rumore di fondo. Il primo canale eccita a 680 nm ed emette a 700 nm per contribuire a quantificare lo sfondo. Il secondo canale rileva fluorofori che eccitano a 780 nm ed emette a 800 nm. Scansione delle cellule MDCK PR8-infetti nello scanner IR indicato un titolo virale-dipendente fluorescenza. Una correlazione positiva di intensità di fluorescenza a titolo virale a partire dal 10 ² -10 ⁵ PFU potrebbe essere conconsistentemente osservato. Positività Minimal ma rilevabile sempre visto con 10 ² -10 ³ PFU PR8 titoli virali dimostrato l'elevata sensibilità delle near-IR coloranti. Il rapporto segnale-rumore è stata determinata confrontando i mock-infettate o cellule MDCK anticorpi isotipo-trattati.

Utilizzando le intensità di fluorescenza da 96 - o formati piastra da 384 pozzetti, abbiamo costruito curve di titolazione standard. In questi calcoli, la prima variabile è il titolo virale mentre la seconda variabile è l'intensità di fluorescenza. Pertanto, abbiamo usato la distribuzione esponenziale per generare una curva-fit per determinare la relazione polinomiale tra i titoli virali e intensità fluorescenza. Collettivamente, possiamo concludere che IR dye-based sistema di rilevazione delle proteine ​​può aiutare a diagnosticare infettare i ceppi virali e precisamente enumerare il titolo degli agenti patogeni infettanti.

Protocol

1. MDCK cellule cultura

1. Cultura 5 milioni di cellule MDCK pernottamento in centimetri-75 T ² pallone in 20 ml di RPMI1640 mezzo completo con 10% FBS, 100 U / ml di penicillina, 100 pg / ml streptomicina, 1 piruvato sodio mM, 5% di bicarbonato di sodio 7,5% soluzione e 0,001% β-mercaptoetanolo in uno 37 ° C incubatore infuso con 5,2% CO _2.

2. PR8 infezione e la raccolta di liquido BAL

1. Sfida C57BL / 6 topi intranasale con 5.000 PFU di PR8 virus in sterile PBS in un volume totale di 30 pl attraverso una narice. Effettuare infezioni finte usando solo PBS sterile senza il virus.
2. Euthanize topi 0, 2, 4 e 7 giorni dopo l'infezione e tagliare la cavità toracica aprire e fare un 1 parallela incisione centimetro alla trachea attraverso la pelliccia del mouse per esporla.
3. Effettuare una incisione mediana sulla aspetto prossimale della trachea.
4. Infondi la trachea con 0,5 ml di PBS-1% BSA e aspirare il BAL fluido. Fluidi BAL possono essere memorizzati in congelatore a -20 ° C fino utilizzato.

3. Infezione da virus e l'individuazione di proteine ​​della matrice virale (M2) con la LI-COR Odyssey

1. Per quantificare i titoli virali che utilizzano raggi infrarossi dye-anticorpi coniugati, raccogliere le cellule MDCK da T-75 cm ² palloni e la piastra in fondo nero ottica piatto a 96 pozzetti (10.000 cellule per pozzetto) o 384 (oltre 5.000 cellule per pozzetto ) piatti. Cultura le cellule MDCK per notte a 37 ° C in RPMI1640 mezzo completo e lavare due volte con serum-free DMEM contenente BSA (0,2%, peso / volume), penicillina (100 U / ml), streptomicina (100 pg / ml), sodio piruvato (1 mM), soluzione di sodio bicarbonato (5% del 7,5%) e β-mercaptoetanolo (0,001%).
2. Incubare le cellule MDCK con fluido BAL (50 microlitri per 96-well piastra o 10 microlitri per piastra a 384 pozzetti) o PR8 virus con titoli noti in ciascun pozzetto con volume uguale (50 microlitri per 96-well piastra o 10 microlitri per 384 - ben piastra) di medium DMEM,contenente L-1-tosylamido-2-feniletile chetone clorometil (TPCK)-trattata tripsina (0,2 pg / ml).
3. Dopo 1 h di infezione, aggiungere 100 microlitri (piastra a 96 pozzetti) o 20 pl (piastra a 384 pozzetti) del 10% FBS-contenente RPMI1640 mezzo completo a ciascun bene.
4. Continuare coltivazione di cellule MDCK per un'altra h 16 di infezione; lavare le cellule MDCK due volte con 100 pl (piastra a 96 pozzetti) o 20 pl (piastra a 384 pozzetti) di PBS-1 soluzione BSA% e fissare con 100 pl (96-bene piastra) o 20 pl (piastra a 384 pozzetti) del 1% paraformaldeide per 5 min.
5. Seguendo fissaggio, incubare le cellule MDCK ulteriormente per 30 min con 100 pl (piastra a 96 pozzetti) o 20 pl (piastra a 384 pozzetti) di PBS-1% BSA per il blocco.
6. Dopo il bloccaggio incubare le cellule MDCK per per 1 h con anticorpo primario contro la proteina M2 (1:1000, diluito in PBS-1% BSA). Utilizzare 50 microlitri per pl bene e 20 di anticorpo diluito, per pozzetto in 96-ben o 384-bene piastre, rispettivamente.
7. Lavare le cellule MDCK tre volte con 100 pl (piastra a 96 pozzetti) O 20 pl (piastra a 384 pozzetti) di PBS-contenente 1% BSA e incubare per 1 h con 50 microlitri (piastra a 96 pozzetti) o 20 pl (piastra a 384 pozzetti) capra anti-topo IRDye @ 800 anticorpo secondario ( 1:200 diluizione).
8. Lavare le cellule MDCK tre volte con 100 pl di PBS-contenente BSA 1%. Posizionare le piastre colorate sulla piattaforma lettura di vetro dello scanner Odyssey LI-COR IR e impostare il lettore per un 96 - o la lettura piastra a 384 pozzetti.
9. Blank pozzetti di controllo negativi può essere impostato utilizzando il LI-COR software Odyssey. Quantificare intera piastra o pozzetti selezionati all'interno di lastra, con LI-COR software Odyssey.
10. Utilizzando lo strumento forma automatica, disegnare i confini di una regione bersaglio (ROI) nel bel mezzo di un pozzetto di 96 - o 384 pozzetti. Creazione di ROI permette al software di confrontare i pozzi di fondo definite ai campioni di virus titolati.
11. Per impostare il valore di base per il dosaggio intero, utilizzare un ROI sfondo. Introdurre i due mirino opposti forniti dal software Odyssey entro il ROI di misure l'intensità della fluorescenza attraverso il bene.
12. Scansione piastre con canale 780 nm per il rilevamento e 680 nm come lunghezza di riferimento in uno scanner Odyssey LI-COR IR.
13. Una volta che il comando 'Read' è attivata, le intensità di fluorescenza a intervalli uniformi del ROI saranno misurati ei dati raccolti punti integrati. Un moltiplicatore deviazione standard determinerà il livello del segnale sul baseline che è incluso nella determinazione ROI.
14. Fluorescenza Background verranno quantificati dal anticorpo mock-infetto o secondaria da solo controlla e saranno utilizzati per stimare la intensità integrata in pozzetti test.
15. Ha scelto 'intensità integrata' per i calcoli, perché rappresenta il volume netto pixel per un posto definito individuo ed è indipendente dalla dimensione del tratto. Utilizzare la curva standard dei titoli virali conosciuti per il calcolo dei titoli virali di campioni sconosciuti. Utilizzare una lunga curva di interpolazione per calcolare con precisione i titoli virali. Calcolare la vtitoli iral nei campioni prova da parte confrontando le intensità dei campioni di prova con la curva standard.

4. Risultati rappresentativi

Standardizzazione delle IR dye-based ad alta velocità sistema di rilevamento virale

PR8 virus possono infettare le cellule MDCK, quindi, abbiamo usato queste cellule per sviluppare questo test. Abbiamo misurato i titoli virali utilizzando un anticorpo primario contro una proteina virale matrice influenza (M2). A differenza di altre metodologie, abbiamo usato un anticorpo secondario che è coniugato ad un vicino-IR colorante. Questo metodo fornisce un modo semplice, automatico PR8 determinazione del titolo virus mediante l'intensità di fluorescenza che viene generato durante il rilevamento proteina M2. Dopo l'infezione influenzale virus, proteina M2 è tradotta, trasportato e accumula nella cellula ospite compresa la superficie cellulare. Così, la quantità della proteina M2 rappresenta un parametro misurabile per determinare la quantità del virus. Confrontando le intensità dii campioni di prova con la curva standard fornisce la misurazione precisa di titoli virali.

Per determinare l'efficacia del fluorescenza-based metodo, abbiamo coltivate 10 ⁴ cellule MDCK / bene in camera scorre durante la notte. PR8 stock virali di titoli noti sono stati aggiunti per duplicare pozzetti con unità placca diverse formanti (PFU) e consentito di adsorbire sulle cellule per un'ora. Le cellule sono state incubate per 16 h per consentire il virus per propagarsi. Dopo questo, le cellule MDCK nelle diapositive camera sono stati fissati con 1% paraformaldeide, lavato e colorate con anticorpi anti-M2 anticorpo per 1 h, seguito da AlexaFluor 488-coniugato anticorpo secondario per un ulteriore 1 h. Confocali analisi microscopiche di infettate cellule MDCK dimostrato il monostrato aderente era in gran parte intatta e la PR8-derivata proteina M2 era abbondantemente presente all'interno delle cellule infettate MDCK (Figura 1A). Cellule fluorescenti potrebbe essere rilevato in infezioni con titoli virali basso quanto 10 ²

Pertanto, per stabilire un metodo preciso di stima virale abbiamo impiegato un IR dye-based sistema di rilevamento e la quantificazione. Cellule MDCK (10 ⁴ / pozzetto) sono state coltivate in piastre a 96 pozzetti, infettati con PR8 e proteine ​​virali sono stati rilevati utilizzando anti-M2 seguita da uno IR colorante-coniugato anticorpo secondario. L'uso di anti-M2 anticorpo ci ha permesso di utilizzare l'antigene-specifica intensità di fluorescenza come una metrica diretta di quantità virale. Per enumerare l'intensità di fluorescenza, abbiamo usato il LI-COR Odyssey scanner basato su IR. Questo sistema utilizza due canali laser-basEd rilevamenti IR per identificare fluorofori e differenziarli dal rumore di fondo. Il primo canale eccita a 680 nm ed emette a 700 nm per contribuire a quantificare lo sfondo. Il secondo canale rileva fluorofori che eccitano a 780 nm ed emette a 800 nm. Scansione delle cellule MDCK PR8-infetti in LI-COR Odyssey indicato un titolo virale-dipendente fluorescenza (Figura 1B). M2 positive cellule fluorescenti MDCK erano chiaramente visibili all'interno della pozzetti (Figura 1B). Una correlazione positiva di intensità di fluorescenza a titolo virale a partire dal 10 ² -10 ⁵ PFU potrebbe essere costantemente osservati. PR8 titolazioni virali superiore a 10 ⁶ piombo PFU alla morte delle cellule, che fissa un limite superiore per la sensibilità del test. Positività Minimal ma rilevabile sempre visto con 10 ² -10 ³ PFU PR8 titoli virali dimostrato l'elevata sensibilità delle near-IR coloranti. Il rapporto segnale-rumore è stata determinata confrontando la mock-infettato o isotipici cellule MDCK anticorpo-trattati. Entrambi questi controlli portato in livelli trascurabili o non rilevabili di fluorescenza (figura 1B).

Per migliorare ulteriormente la sensibilità e di ridurre i requisiti del campione volume di prova, abbiamo infettato 5 × 10 ³ cellule MDCK / ben in piastre a 384 pozzetti. PFUs Differenti di PR8 sono state testate come seriali uno diluizioni log (Figura 1C). Sensibilità Detection da piastre 384-pure era paragonabile a quella dei 96-pure saggi piastra. Sia 10 ¹ e 10 ² PFU operato con costanza meglio nelle piastre 384-bene rispetto a 96-pozzetti. Utilizzando le intensità di fluorescenza da 96 - o formati piastra da 384 pozzetti, abbiamo costruito curve di titolazione standard (Figura 1D). In questi calcoli, la prima variabile è il titolo virale mentre la seconda variabile è l'intensità di fluorescenza. Pertanto, abbiamo usato la distribuzione esponenziale per generare una curva-adatta a Determnare il rapporto polinomio tra i titoli virali e intensità fluorescenza. Abbiamo anche convalidato nostre osservazioni utilizzando un altro anticorpo che è diretto contro il nucleoproteina (NP) di PR8 virus (dati non mostrati). Fonti Distinct di PR8 ceppi sono stati utilizzati anche per infettare cellule MDCK che sono stati testati con anti-NP o anti-M2 anticorpi (dati non mostrati). Collettivamente, possiamo concludere che IR dye-based sistema di rilevazione delle proteine ​​può aiutare a diagnosticare infettare i ceppi virali e precisamente enumerare il titolo degli agenti patogeni infettanti.

Considerazioni matematiche per il calcolo dei titoli virali

I calcoli matematici di intensità di fluorescenza e determinazioni dei titoli anticorpali sono fatto come descritto di seguito. A seguito della procedura di colorazione, la piastra tutto o pozzetti selezionati all'interno di piastra sono quantificati con l'aiuto LI-COR software Odyssey. Utilizzo Strumento Auto Shape, frontiere di una regione bersaglio (ROI) è stata disegnata nel mezzo dei pozzetti di prova di 96 - o 384-noipiastre LL (Figura 2A e B). Creazione di ROI permette al software di confrontare i pozzi di fondo definite ai campioni di virus titolati. Un ROI sfondo è stato utilizzato per impostare il valore basale per il dosaggio intero. Due peli opposte croce (bianco) state presentate entro il ROI per misurare l'intensità della fluorescenza attraverso il ben (Figura 2C). Curve verso il lato destro e sotto i pozzi rappresentativi in Figura 2C rappresentare l'intensità dei pixel lungo questi peli croce. Le intensità di fluorescenza a intervalli uniformi del ROI sono stati misurati ed i punti dati raccolti sono stati integrati. Un moltiplicatore deviazione standard determinato il livello del segnale sopra la baseline che è stato incluso nella determinazione ROI. Background fluorescenza è stata quantificata dalla anticorpo mock-infetto o secondaria soli controlli e utilizzato per stimare la intensità integrata in pozzetti test. Abbiamo scelto intensità integrata per calcoli perché esso rapprevolume di pixel genitori netto per un singolo punto definito ed è indipendente dalla dimensione del tratto. Inoltre, intensità integrata è sostanzialmente indipendente di risoluzione. Intensità Total / pixel (I) corrisponde all'intensità del segnale derivante dalla selezionato bene nella zona pixel (Is) più il segnale derivante dallo sfondo dell'area di pixel (b). Pertanto, per pixel 'i':

I i = I + s i b i

Volume di Pixel rappresenta sia la grandezza del segnale e la zona in cui è distribuita. Zona Signal è collegata alla distribuzione di campione che sta generando il segnale. Il volume pixel è uguale al segnale totale misurato in pixel 'i' nella zona (a) del pixel volte la sua altezza (I). Così, per pixel 'i':

vi = a I i

Volume di pixel totale è la somma del segnale totale di tutta l'area in questo modo:

;	n		n
V =	Σv i	=	aΣI i
	i = 1		i = 1

Intensità integrata è la somma dei valori di intensità di tutti i pixel racchiusi da funzionalità, moltiplicato per l'area del cerchio / rettangolo (count mm ^2). Pertanto, l'intensità integrato =

uno (ΣI _i - b)

Qui, b sta per l'intensità media pixel di sfondo. Questa formula calcola le intensità di segnale integrati del controllo o pozzetti sperimentali e stabilisce in tal modo una curva standard. Titoli virali nei campioni analizzati sono stati calcolati utilizzando questa curva standard. Concentrazione (di intensità) è definita come la quantità di presente fluorescenza in uno ROI definito. Le concentrazioni nei campioni di prova sono i calcoliTed relativi alle concentrazioni definite delle norme nella stessa immagine. Per calcolare i titoli precisi virali, l'intensità di ciascuna norma di concentrazione è tracciata e dotato di una curva interpolazione lunga. Le concentrazioni dei campioni test sono calcolati confrontando l'intensità della area all'interno della curva standard.

Determinazione di titoli virali da fluido BAL di topi influenzali infetti

Rilevamento di particelle virali influenzali in diretta in campioni clinici e di laboratorio è di importanza critica. Pertanto, abbiamo prossima esaminato se possiamo utilizzare questo metodo per determinare i titoli virali in campioni di laboratorio. Fluidi BAL sono stati raccolti dai topi non immunizzati ed è stata aggiunta una quantità nota di PR8 virus. Spiked fluidi BAL sono stati linearmente titolato per enumerare i titoli virali. Aliquote di chiodate fluidi BAL sono stati utilizzati per infettare cellule MDCK in piastre a 96 pozzetti, fissate e colorate con anti-M2 e IR dye-coniugato secondary anticorpi. I risultati mostrati in figura 3A dimostrare che i titoli virali nel fluido spiked BAL erano rilevabili e correlata con le PR8 titoli nella curva standard. Utilizzando la curva standard, i numeri precisi virali nel liquido arricchito e titolato BAL è stata quantificata. Esponenziali calcoli fit curva fornito una misura per calcolare le titoli virali nel liquido spiked BAL (Figura 3B). Con questo metodo abbiamo ottenuto ottimi correlazioni tra i titoli calcolati ed è stata aggiunta virali, convalidando questo approccio (Figura 3C).

Successivamente, abbiamo analizzato il liquido BAL da PR8 topi infettati. PR8 è stato ampiamente utilizzato in modelli murini di comprendere umano ³ patologia e l'immunità anti-virale. Gruppi di topi sono stati infettati per via intranasale con 5.000 PFU di PR8. I topi sono stati monitorati per la perdita di peso, comparsa di gobba, pelliccia arruffata e altri sintomi clinici. Nei giorni 0, 2, 4, 7 e 10 di post-infezione,topi sono stati sacrificati e fluidi BAL sono stati raccolti. Per utilizzare questi campioni di laboratorio, cellule MDCK sono state incubate con diluizioni seriali di fluido BAL in un volume finale di 50 microlitri per 17 h in piastre da 96 pozzetti. I pozzetti di controllo MDCK di cellule infettate con titoli noti delle scorte PR8 virus è servito a generare una curva standard. Dopo l'infezione, le cellule sono state lavate, fissate e colorate con anti-M2 anticorpo primario seguita da vicino-IR dye-coniugato anticorpo secondario. Cellule MDCK che erano mock-infettati o trattati con controlli isotipici dopo l'infezione a condizione che le intensità di fluorescenza di fondo per i calcoli titolo.

Analisi del liquido BAL ha dimostrato che PR8 virus nel campione laboratorio è rilevabile attraverso il dye-based sistema di analisi IR. Un aumento significativo del carico virale nel fluido BAL è stata osservata nei giorni 2 e 4 post infezione (Figura 4A). Calcoli di intensità integrata indicato che i fluidi di BAL giorni 2 e 4 i postnfection conteneva livelli significativi di PR8 virus (Figura 4B). I nostri risultati mostrano una perdita di peso graduale ma significativa durante la fase precoce di PR8 dell'infezione, dimostrando la gravità della malattia. Tuttavia, la maggior parte dei topi ha iniziato il recupero dai sintomi della malattia e aumento di peso sette giorni dopo l'infezione (Figura 4C). Mice nel giorno 10 dopo l'infezione mancava di qualsiasi PR8 rilevabile indicante la clearance del virus, che anche correlata con l'aumento in peso corporeo e riduzioni considerevoli dei sintomi della malattia.

Per estendere ulteriormente l'applicazione di questo saggio, abbiamo testato un 2009 A (H1N1) dell'influenza umana isolare con IR dye-based sistema di anticorpo di rilevazione e lo ha confrontato con il real-time PCR. Il campione clinico è stato isolato da un tampone nasofaringeo combinato / gola ottenuto dal paziente sospetto. L'isolato è stato propagato nella linea cellulare MDCK presso il Dipartimento di Salute Milwaukee Laboratory. I risultati dei test sono stati comparosso per verificare la sensibilità del IR colorante-based metodo per real-time PCR (Figura 5). I risultati indicano che l'IR colorante-based sistema di rilevamento anticorpo ha il potenziale per rilevare carico virale basso quanto 10 ³ TCID ₅₀ / ml, che è paragonabile a PCR-saggio basato (10 TCID ₅₀ / ml) e rientrano la rilevanza clinica range per la maggior parte dei campioni dei pazienti. Questi risultati forniscono una forte evidenza che l'IR dye-based sistema di analisi è sufficiente sensibilità e le potenzialità da applicare per il conteggio titolo virale in laboratorio di ricerca e cliniche.

Figura 1. IR dye-based rilevazione immunitaria del virus dell'influenza. (A), analisi al microscopio confocale di influenza le cellule infettate dal MDCK a 8-diapositive e da camera. Immunofluorescenza analisi al microscopio dimostrare la monostrato aderente MDCK è in gran parte intatto e carico di virus di derivazione M2 proteina. (BC) Quantificazione dei titoli virali a base di colorante e IR LI-COR sistema Odyssey. (D) Generazione di curve standard e curve esponenziali-fit profili. I dati presentati in AD sono rappresentative di cinque esperimenti indipendenti.

Figura 2. Metodologia di determinazione titoli virali che utilizzano coloranti IR. (A) misure integrate di intensità di fluorescenza. Una zona definita all'interno del pozzetti prova (ROI) è stato caratterizzato per misurare le intensità di fluorescenza. Utilizzando forma dell'utensile Auto, confini del ROI sono stati elaborati nel bel mezzo dei pozzi di prova di 96 - o 384 pozzetti. Fluorescenza è stata misurata come singoli pixel (pixel = n) all'interno del ROI. Intensità integrata è la somma dei valori di intensità di tutti i pixel racchiusi da funzionalità, moltiplicato per l'area del cerchio / rettangolo (count mm ^2). (B) Determinazione delle intensità di fluorescenza integrati in pozzetti. Creazione di ROIpermesso di LI-COR scanner per confrontare i pozzi di fondo definite per i campioni di virus titolati. Background fluorescenza è stata quantificata dalla anticorpo mock-infetto o secondaria soli controlli e utilizzato per stimare la intensità integrata in pozzetti test. (C) Raccolta di punti dati all'interno del ROI. Due peli opposte croce (bianco) state presentate entro il ROI per misurare l'intensità della fluorescenza attraverso il bene. Curve verso il lato destro e sotto i pozzetti rappresentativi rappresentare l'intensità dei pixel lungo questi peli croce.

Figura 3. Individuazione e quantificazione dei virus titoli in PR8 fluidi a spillo BAL. (A) MDCK cellule sono state coltivate in piastre da 96 pozzetti durante la notte e ha aggiunto con PR8-spillo BAL. Piastre sono state lette nel LI-COR sistema Odyssey. (B) esogena fluido a spillo BAL è stato confrontato con le curve standard. (C) Confronto tra calcolato vir previsto Al titoli. Montaggio di curva esponenziale prevista y = 9.4784e ^0.0014x. I dati presentati in AC sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti.

Figura 4. Individuazione e quantificazione dei virus dell'influenza nei fluidi BAL PR8 da topi infetti. (A) gruppi di topi sono stati infettati per via intranasale con 5.000 PFU di PR8. Cellule MDCK sono state incubate con diluizioni seriali di fluido BAL in un volume finale di 50 microlitri per 17 h in piastre da 96 pozzetti. Dopo l'infezione, le cellule sono state lavate, fissate e colorate con anti-M2 anticorpo primario seguita da IR colorante-coniugato anticorpo secondario. Il pannello all'estrema destra rappresenta la curva standard. (B) Quantificazione dei titoli virali nel liquido BAL di topi infetti. (C) La perdita di peso dei topi durante il PR8 l'infezione correlata con il carico virale. I dati presentati in AC sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti.

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Figura 5. Individuazione e quantificazione del 2009 A (H1N1) (pdm) L'influenza isolato da un paziente umano. (A) L'IR dye-based sistema di rilevamento degli anticorpi a fluorescenza per piegare a metà titolazione della linea cellulare infetta MDCK. I risultati fluorescenza indicano che il campione ha il potenziale per rilevare carico virale basso quanto 10 ³ TCID ₅₀ / ml. (B) L'acido nucleico estratto dalla cultura isolare con seriali dieci diluizioni di un noto H1N1 isolato titolati sono stati analizzati con il test real-time PCR CDC ^12. Il limite di rilevazione per real-time PCR era di 10 TCID ₅₀ / ml.

Discussion

Lo scoppio recente epidemia di influenza aviaria nel Sud-Est asiatico e la paura globale della pandemia di influenza suina impongono enormi preoccupazioni per la salute e la sicurezza pubblica. Attenzione critica è stata dedicata nel generare vaccini per i ceppi esistenti e nuovi di virus influenzale. Disponibilità di rapide tecnologie high-throughput per la rilevazione precisa ed accurata calcoli titolo virale sarà migliorare enormemente il trattamento. Le tecniche più comunemente utilizzate per il calcolo impiegati titolo virale comprendono saggi emoagglutinazione la formazione della placca e l'influenza. Il saggio la formazione della placca è stato inizialmente sviluppato per stimare i titoli batteriofagi ed è stato adottato da Renato Dulbecco per calcolare animali titoli virali ^4. Per eseguire questo saggio, 10-diluizioni di archivio di influenza o di esemplari di animali, quali fluidi BAL sono preparati e 0,1 ml sono inoculate sul monostrato di cellule MDCK in 6-pozzetti. Il virus è permesso di adsorbire sulle cellule MDCK seguite da l'annunciodizione di un mezzo nutriente e agarosio. Durante l'incubazione, le celle originali infette rilasciare progenie virale che si diffuse solo per le cellule vicine. L'effetto citopatico dell'infezione influenzale virale produce una zona circolare di cellule infettate chiamato una targa. Ogni placca viene presumibilmente formata dopo infezione di una singola cella con una particella virus singolo seguito da replicazione del virus. Contrasto tra le cellule viventi e delle targhette possono essere arricchito da coloranti come la violetta cristallo. Un inconveniente principale di questo saggio è la mancanza di riproducibilità e di enormi variazioni all'interno di esperimenti. Un'altra dosaggio utilizzato per determinare il titolo virale influenzale è il dosaggio emoagglutinazione. La presente proteina emoagglutinina sulla superficie del virus influenzale si lega in modo efficiente per N-acetilneuraminico-proteine ​​contenenti su mammiferi e aviaria globuli rossi ^1. Questa interazione tra il virus influenzale e gli eritrociti conduce al agglutinazione in forma di un reticolo. Il lEvel di agglutinazione viene utilizzato per stimare il titolo del virus dell'influenza in campioni. Test di agglutinazione degli eritrociti viene utilizzata solo per determinare la titolazione di un virus noto e non può essere utilizzato a fini di identificazione estensimetri. Dal momento che questo test non fa differenza fra la vita e la morte dei virus, è difficile ottenere un calcolo preciso di titoli virali.

Attuali diagnosi cliniche di infezioni influenzali si basano su test sierologici, reazione a catena della polimerasi, immunofluorescenza diretta del campione e la cultura delle cellule ^1,6. Il nuovo metodo descritto qui ha anche clinico e di laboratorio potenziale diagnostico. Influenza rilevamento kit Directigen FLU-A (BD Biosciences, San Jose, CA) e BinaxNOW (Binax, Inc., Scarborough, ME) immunocromatografia test utilizzare per rilevare l'antigene virale, come nucleoproteina ^7. L'utilizzo di questi kit, il rilevamento di virus possono essere raggiunti entro 15 minuti, tuttavia, tutti i campioni negativi devono essere ulteriormente screened dal metodo coltura cellulare. Diversi studi hanno anche riportato bassa sensibilità di questi kit, in particolare, quando l'infezione era lieve o basso ^8. Nel nostro metodo, abbiamo costantemente rilevare a partire da 100 PFU di virus. Questo suggerisce la nostra tecnica è utile per rilevare virus H1N1 in campioni clinici, anche quando l'infezione è mite. Un metodo basato sulla fluorescenza per rilevare antigeni virali è stata riportata, in cui sia campioni di aspirato nasofaringeo sono stati analizzati direttamente o sono state inoculate su un monostrato di cellule sensibili alla moltiplicazione del virus e le analisi successive ^9. Tuttavia, questi metodi sono limitati per scopi diagnostici e non sono adatti per calcoli titolo virale. Q-PCR aiuta a identificare la presenza di RNA virale e non stimare la infettività di virus vivi. Rispetto a questi saggi, IR dye-based sistema di analisi aiuterà nella ricerca e la conta titolo virale in campioni clinici e di laboratorio. In caso di focolaio di influenza, ècritico per diagnosticare migliaia di campioni in un periodo di tempo breve. Il nostro metodo basato su una piastra a 384-bene e scanner IR possibile eseguire la scansione 6-piastre alla volta (> 2.000 campioni), offrendo pertanto un vantaggio maggiore rispetto ad altri metodi diretti fluorescenti. Fattibilità di un trattamento rapido di migliaia di campioni clinici potrebbero ridurre la variabilità di prova, la durata del tempo di saggio e di costi. L'uso di un M2-specifico anticorpo offre il vantaggio di essere indipendente di differenze di ceppi in proteine ​​H e N. La proteina M2 è relativamente conservata nella maggior parte dei ceppi influenzali che infettano gli esseri umani. Se gli anticorpi specifici per macchie circolanti sono combinati con il nostro sistema uno può misurare sia il titolo di virus e identificare il ceppo. Tuttavia, poiché M2 è l'obiettivo per i farmaci come amantadina, i mutanti possono nascere che potrebbe cambiare il sito di legame per l'anticorpo monoclonale usato qui. Questo rappresenta una potenziale limitazione di questo sistema negli individui che vengono trattati con questi farmaci.

Multiplosaggi vengono utilizzati per enumerare i titoli influenzali nei campioni di prova. Per calcolare virus titolo, 50% della dose coltura tissutale infettiva (TCID ₅₀₎ e uova allantoici fluido-saggi basati sono ampiamente utilizzati ^1,10. Tuttavia, i requisiti di più giorni rendono questi metodi meno affidabile. Inoltre, in questi metodi calcoli basati sulla variazione 50% nel il numero di placche fornire titolazioni virali teoriche ma non accurate. La formazione della placca analisi può essere eseguita entro 96 ore, tuttavia, la mancanza di riproducibilità è un problema importante nei calcoli titolo virale. La presente tecnica descritta qui ha diversi vantaggi. In primo luogo, essa è una tecnica altamente riproducibile con esiti coerenti. In secondo luogo, i calcoli titolo virale si basano sulla quantificazione semplice intensità di fluorescenza che vengono confrontati con le curve standard definiti. Terzo, due o più anticorpi primari può essere utilizzato per diagnosticare sierotipi multipli in un dato campione. Inoltre, IR dye-anticorpi coniugati sono minimal autofluorescenza e sono stati utilizzati per cella l'imaging ^11. UV o visivo radiazioni (300-600 nM) risultati in alta autofluorescenza cellulare dovuta alla presenza di elevati quantistica fluorofori rendimento endogene. Questi includono gli amminoacidi aromatici, lipo-pigmenti, nucleotidi pyridinic (NADPH), elastina, collagene e coenzimi Flavin. Questa proprietà intrinseca di cellule rende difficile utilizzare queste fonti di radiazioni come sonde per quantificare l'espressione di proteine ​​specifiche. Al contrario, near-IR coloranti emozionare ed emettono tra i 670-1000 nm. Molte molecole host cellulari e gli idrocarburi policiclici aromatici non eccitano a questa lunghezza d'onda e grazie alla riduzione della dispersione della luce, emettono fluorescenza di fondo estremamente basso. Inoltre, la finestra tra lo sfondo e rilevazione specifico è molto migliorato a causa di un coefficiente elevato di estinzione delle vicino-IR fluorofori. Fotostabilità, superiore rapporto segnale-rumore, è estremamente rilevante nella quantificazione dei titoli virali. Uso di microflcamere uidic automatizza il processo di screening attraverso controlli robotici, e potrebbe consentire di testare campioni clinici altamente contagiose con facilità. Così, l'utilizzo di vicino-IR coloranti in questi metodi è ideale e altamente affidabile per enumerare titoli virali in campioni di tessuto.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Bovina albumina sierica	Atlanta Biologicals	S11750
PR8 virus			Dal Dr Thomas Moran M
Capra anti-topo IRDye @ 800	LI-COR bioscienze	926-32210	1:200 diluizione
LI-COR Odyssey IR scanner	LI-COR-bioscienze	9201-01
384 pozzetti della piastra di fondo piatto	Nalge Nunc internazionale	164730
96-pozzetti della piastra di fondo piatto	Nalge Nunc internazionale	165305
DMEM media	Invitrplasminogeno	11965126
Medium RPMI	Invitrogen	11875135
Bicarbonato di sodio	Invitrogen	25080
L-glutammina 100x	Invitrogen	25030
Trypson-EDTA	Invitrogen	R001100
Sodio Piruvato	Invitrogen	11360070
Anti-M-2 anticorpo			Dal Dr Thomas Moran M
Anti-NP mAb	CDC	V2S2208	Ottenuto con un MTA