Articolo metodologico

In Assemblea in vitro di semi-artificiale della macchina molecolare e il suo utilizzo per il rilevamento del danno al DNA

DOI:

10.3791/3628

⸱

11 gennaio 2012

 , 
1Neurosurgery, Baylor College of Medicine , 2Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 3Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Dimostriamo il montaggio e l'applicazione di una scala molecolare dispositivo alimentato da una proteina topoisomerasi. Il costrutto è un bio-sensore molecolare che le etichette due tipi principali di rotture del DNA nelle sezioni di tessuto allegando due fluorofori diversi per i loro fini.

Abstract

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Naturale bio-molecolari macchine lavorano in ogni cellula vivente e visualizzare una varietà di disegni 1-6. Eppure lo sviluppo di macchine molecolari artificiali centri su dispositivi in grado di movimento direzionale, cioè motori molecolari, e sulla loro parti meccaniche in scala ridotta (ruote, assali, ecc pendenti) 7-9. Questo imita la macro-macchine, anche se le proprietà fisiche fondamentali per questi dispositivi, come ad esempio inerzia e conservazione del momento, non sono utilizzabili in ambienti nanomondo 10. Progetti alternativi, che non seguono gli schemi meccanici macromachines e utilizzare meccanismi sviluppati per l'evoluzione delle molecole biologiche, possono usufruire delle condizioni specifiche del nanomondo. Inoltre, adattando reale molecole biologiche ai fini della nano-design riduce i pericoli potenziali dei prodotti delle nanotecnologie potrebbero comportare. Qui mostriamo il montaggio e l'applicazione di uno di questi bio-enabled costruire, comeemi-artificiale dispositivo molecolare che combina una macchina in natura molecolare con componenti artificiali. Dal punto di vista enzimologia, il nostro costruire è una fluorescente progettista enzima-substrato complesso mettere insieme per svolgere una specifica funzione utile. Questa assemblea è per definizione una macchina molecolare, in quanto contiene un 12. Eppure, la sua integrazione con le progettato parte - fluorescenti a doppio tornante - ha re-indirizza a una nuova attività di etichettatura danno al DNA 12.

Il nostro costruire assembla da un 32-mer DNA e un enzima vaccino topoisomerasi I (VACC TOPO). La macchina utilizza poi il proprio materiale per fabbricare due unità rivelatore fluorescente (Figura 1). Una delle unità (fluorescenza verde) porta VACC TOPO covalentemente legata al suo 3'end e un'altra unità (fluorescenza rossa) è un tornante libero con un 3'OH terminale. Le unità sono di breve durata e rimontare rapidamente nuovamente dentro il costrutto originale, che recleaves successivamente.In assenza di rotture del DNA queste due unità separate e in continuo religate in modo ciclico. In sezioni di tessuto con danno al DNA, la topoisomerasi che trasportano unità di rilevatore si attacca selettivamente a blunt-ended con 5'OH rotture del DNA (DNasi II di tipo break) 11,12, fluorescente loro etichettatura. Il secondo, enzima senza tornante formata a seguito della scissione oligonucleotidi, sarà legare ad un 5'PO 4 smussato-ended break (DNasi I di tipo break) 11,12, se il DNA ligasi T4 è presente nella soluzione 13,14. Quando il DNA ligasi T4 viene aggiunto a una sezione di tessuto o di una soluzione contenente DNA con 5'PO 4 blunt-ended pause, la ligasi reagisce con 5'PO 4 estremità del DNA, formando semi-stabile enzima-DNA complessi. I tornanti smussato conclusa potranno interagire con questi complessi rilasciando tornanti ligasi e il collegamento covalente al DNA, così etichettatura 5'PO 4 blunt-ended rotture del DNA.

Questo sviluppo esemplifica un nuovo approccio pratico °progettazione e di macchine molecolari e fornisce un utile sensore per il rilevamento di apoptosi e danno al DNA nelle cellule e nei tessuti fissi.

Protocollo

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Le sezioni per la macchina molecolare basata rilevamento deve essere preparato prima perché la loro preparazione richiede più tempo rispetto l'assemblaggio del dispositivo molecolare. Il costrutto funziona bene con 5-6μm dello spessore di sezioni tagliate da paraformaldeide-fisso, inclusi in paraffina blocchi di tessuto. Utilizzare i marchi scivolo che mantengono sezioni e, come ProbeOn Inoltre diapositive carica e predepurata (Fisher Scientific) o simili. Si consiglia in un primo momento con un tessuto con un noto modello di danno al DNA che contiene sia I-II e DNasi DNasi tipo pause, come ad esempio trattati con desametasone ratto apoptotici timo 13,14.

1. La preparazione delle sezioni

  1. Posizionare le sezioni in un rack di diapositive e sparaffinatura in xilene per 15 minuti, trasferire in un bagno di xilene fresco per altri 5 minuti.
  2. Reidratare passando attraverso le concentrazioni di etanolo classificato: 96% etanolo 2x5min; Etanolo 80% - 5min; acqua - min 2x5.
  3. Digest sezione con Proteinase K. L'uso 100μL di una soluzione 50μg/mL per sezione. Incubare 15 'a temperatura ambiente (23 ° C) in una camera umidificata. Il tempo può essere necessario regolare a seconda del tipo di tessuto. Tessuti duri potrebbe richiedere più la digestione. Tempi di 15-25 minuti di solito vengono utilizzati. Digestione insufficiente può comportare il segnale più debole. Overdigestion sui risultati d'altra parte nella scomparsa del segnale e la rottura sezione.
  4. Sciacquare con acqua distillata per min 2x10.
  5. Applicare 100 ml di sezione per il 2% BSA per preblocking. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (23 ° C). Durante questo periodo assemblare la macchina molecolare.

2. Macchine per l'assemblaggio molecolare

Tutti i reagenti sono scalati per 25 microlitri di volume totale, che è sufficiente per un rilevamento singolo in una sezione di tessuto media dimensione (10x10mm). Il volume può essere aumentato se necessario.

  1. Combina in un piccolo tubo di plastica in questo ordine:
  1. Acqua bidistillata;
  2. Polietilene glicole-8000 al 15%;
  3. Soluzione di 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 0.1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP, (cioè normale tampone T4 DNA ligasi);
  4. 70 pmoli di Oligonucleotidi 1,
  5. 215 pmoli (1,76-7,1 mg) VACC TOPO
  6. 10 unità T4 DNA ligasi (500 U / mL)
  1. Mescolare delicatamente pipettaggio. Il costrutto molecolare quasi istantaneamente auto-assembla in questa soluzione e può essere utilizzato immediatamente a temperatura ambiente (23 ° C). L'aumento della temperatura a 37 ° C blocca la T4 DNA ligasi componente basato su delle etichette.

3. L'utilizzo di macchine molecolari in sezioni di tessuto per 5'OH etichetta dual e 5'PO4 rotture del DNA

  1. Aspirare la soluzione preblocking e applicare 25μL della miscela di reazione completo contenente 70 pmoli di Oligonucleotidi 1, 53-215 pmoli (1,76-7,1 mg) VACCTOPO e 10 unità T4 DNA ligasi (500 U / mL) in soluzione di 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5mm MgCl 2, 0.1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP, e il 15% di polietilene glicole-8000. L'oligonucleotide stessa sequenza portando una sola etichetta FITC, oligonucleotidi 2, può essere usato al posto per il rilevamento di un singolo tipo di rotture del DNA. In tal caso omettere ligasi dalla reazione di marcatura. Anche in questa situazione una soluzione di 50 mM Tris-HCL, pH 7.4, 15% PEG-8000 può essere usato al posto di buffer di T4 DNA ligasi.
  2. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente (23 ° C) in una camera umidificata con un coprioggetto di plastica. Riparo dalla luce. Abbassamento della temperatura a 16 ° C riduce la ligasi a base di segnale, l'aumento della temperatura a 37 ° C elimina completamente la ligasi-based del segnale. Un parziale inibizione di ligasi si verifica a volte nella miscela di reazione, forse a causa di contaminanti introdotti con preparazioni topoisomerasi. Pertanto, più di incubazione (2-4 ore) potrebbe essere necessario soprattutto quando snumeri ignificant di ligasi marcato break sono presenti. Sebbene entrambi i segnali e ligasi topo possono essere osservati in questa fase, in molti casi il segnale ligasi può essere ulteriormente migliorato ri-applicazione della miscela di reazione senza VACC TOPO e dual-etichettati oligonucleotidi, ma contenente un oligonucleotide a forma di gomito (oligonucleotidi 3) (35 mg / mL) e T4 DNA ligasi (250 U / mL). Per migliorare il segnale passare alla Fase 3, per vedere la reazione senza mezzo di passare al punto 5.
  3. Togliere delicatamente coprioggetto immergendo i vetrini verticalmente in una vaschetta Coplin contenente acqua a temperatura ambiente. Aspirare l'acqua in eccesso.
  4. Potenziare segnale ligasi applicando 25 l di miscela di reazione senza VACC TOPO e oligonucleotidi 1, ma contenenti oligonucleotidi 3: 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 0.1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP, 15% e il polietilene glicole 8000, 5 unità T4 DNA ligasi, 35 mg / mL Oligonucleotide 3 (a gomito smussato terminato). Il volume totale della soluzione di etichettatura can essere scalata fino a ospitare le sezioni più grandi. Incubare per 18 ore (una notte) a temperatura ambiente (23 ° C) in una camera umidificata con un coprioggetto di plastica.
  5. Togliere delicatamente coprioggetto immergendo i vetrini verticalmente in vaschetta Coplin contenente acqua a temperatura ambiente. Quindi lavare min 3x10 sezione in acqua distillata.
  6. Sciacquare con tampone bicarbonato di sodio. Soluzione alcalina lavare migliora FITC a fluorescenza, che è sensibile al pH e si riduce notevolmente al di sotto di pH 7.
  7. Profilo di copertura con una soluzione antifading (Vectashield con DAPI), coprioggetto e analizzare il segnale utilizzando un microscopio a fluorescenza. Rotture del doppio filamento di DNA con 5'OH sarà fluorescenza verde, 5'PO 4 break - si fluorescenza rossa (Figura 2).

4. Rappresentante Risultati

figure-protocol-1
Figura 1. Semi-artificiale macchina molecolare individua due tipi diDanno al DNA in situ. La macchina fluorescente auto-assembla quando VACC TOPO si lega al doppio tornante 32-mer. La macchina inizia a funzionare dividendo stesso in due unità rilevatore di via topoisomerasi taglio a misura alla fine del 3 'della sequenza di riconoscimento. Ciò si traduce in un processo ciclico in cui marcata con FITC unità separa in modo continuo e religates nuovo al rodamina marcato unità. Questo fino a quando persiste una rottura del DNA rilevabile si incontra. Quando ad esempio un accettore alternativo (5'OH smussato rottura del DNA fine) è presente nella sezione di tessuto, la parte FITC sarà legare ad essa. La parte restante rodamina attribuirà a 5 'PO 4 break finale del DNA smussato con l'aiuto di DNA ligasi T4. Di conseguenza, entrambi i tipi di rotture del DNA sono rilevati simultaneamente.

figure-protocol-2

Figura 2. Etichette macchina molecolare doppio due tipi di rotture del DNAin una sezione di tessuto di desametasone trattati con timo. Blunt-ended rotture del DNA di DNasi I e II DNasi tipo vengono rilevati nelle aree corticali timici in fase di apoptosi. Fluorescenza verde citoplasmatica (5'OH rotture del DNA), segna macrofagi corticali digerire materiale nucleare di timociti apoptotici. Questo segnale è prodotto da VACC TOPO, e localizza a phagolysosomes con il DNA contenente 5'OH rotture del doppio filamento 11,12. Fluorescenza rossa (5'PO 4 pause) nuclei etichette dei timociti apoptotici non inghiottito da parte dei macrofagi. Un massiccio numero di timociti contemporaneamente apoptosi accompagnata dalla generazione di 5'PO 4 rotture del doppio filamento, visualizzati da ligasi a base di etichettatura. Queste interruzioni sono situati alla periferia nucleare, formando l'anello a forma di modelli. Tutti i nuclei cellulari sono visualizzati da controcolorazione con DAPI (blu fluorescenza).

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Discussione

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In questo video mostriamo come assemblare e utilizzare un dual-etichettatura DNA sensore danni. Il sensore è una macchina molecolare guidata da bio-molecolari motore, un virus-encoded TOPO VACC proteina legata con componenti artificiali. Lo sviluppo ha presentato l'esempio di un bio-enabled approccio che promuove l'adattamento delle strutture biologiche, architetture e componenti effettivi e dei componenti delle cellule alla progettazione di atossici dispositivi su scala molecolare 12,15. Questo appro...

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata sostenuta da concedere R01NS062842 dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke, National Institutes of Health (VVD) e dalle concessioni R21 NS064403 dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke, National Institutes of Health con ARRA (VVD) e R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging e Bioingegneria, National Institutes of Health (VVD).

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Materiali

  1. Xilene
  2. 80 e 96% etanolo.
  3. Soluzione al 2% di albumina di siero bovino (BSA) in acqua distillata.
  4. Oligonucleotide 1: un'arma a doppio tornante, doppio marcato con fluoresceina e tetrametilrodamina:

5'-GGA AAG CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG R CAT IN GCG TT-3 '; F - FITC-dT; R - tetrametilrodamina-dT. Altri rossi spostato fluorofori come BODIPY TR, rodamina o TAMRA può essere usato al posto di tetrametilrodamina come R.

In alternativa puoi usare oligonucleotidi 2 -. Un'arma a doppio tornante singolo marcato con fluoresceina (per il rilevamento di un singolo tipo di rotture del DNA (DNasi II-tipo solo) Il single-fluoroforo che trasporta la sonda è notevolmente meno costoso ed è comodo ogni volta che un singolo tipo di interruzione di DNA viene etichettato: 5'-GGA AAG CCT GC F GCA TTA ACG GGT CCC ATG CGT CAT T-3 '; F - FITC-dT

  1. Oligonucleotide 3. Blunt-ended rodamina marcato tornante per la valorizzazione del segnale legatura in situ con DNA ligasi T4: 5'-GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC-3 '; R - tetrametilrodamina-dT
  2. Vaccinia DNA topoisomerasi l (VACC TOPO) - 3000 U / mL (Tecnologie Vivace). Negli esperimenti iniziali abbiamo usato 215 pmoli (7,1 mcg) del TOPO VACC per ogni microlitri 25 della miscela di reazione. Tuttavia, la concentrazione topoisomerasi può essere significativamente ridotto senza la perdita di sensibilità. Abbiamo poi usato una quantità quattro volte minore di VACC TOPO per sezione (1,76 mg in 25 ml di miscela di reazione per sezione) con risultati simili. Ridurre la quantità di enzima a 880 ng (in 25 microlitri della miscela di reazione) ha determinato un segnale più debole e 8,8 ng di VACC TOPO non ha prodotto alcun segnale rilevabile.
  3. DNA ligasi T4 5 U / mL (Roche). Questa preparazione ligasi altamente concentrati dà il meglio di segnale nelle nostre condizioni sperimentali.
  4. 10 x tampone di reazione per la DNA ligasi T4: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 10 dithioerythritol mm, 10 mm ATP, pH 7.5 (20 ° C) (Roche). ATP in tampone di reazione è facilmente distrutto in cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Aliquota del buffer in piccole porzioni 15-20 microlitri e conservare a - 20 ° C. Utilizzare una sola volta.
  5. 30% (w / v) di PEG-8000 (Sigma) in acqua bidistillata. 15% PEG-8000 nella miscela di reazione stimola fortemente la rilevazione, aumentando la concentrazione efficace dei suoi componenti per esclusione del volume.
  6. Proteinasi K (Roche) 20 mg / ml soluzione madre in acqua distillata. Conservare a - 20 ° C. Nella soluzione uso reazione 50mg/ml in PBS, prepara il. Non riutilizzare.
  7. Vectashield con DAPI (Vector Laboratories).
  8. Tampone bicarbonato di sodio: 50m M NaHCO 3, 15m M di NaCl, pH 8.2.
  9. Vetro 22x22mm o 22x40mm o lamelle di plastica. Coprioggetto plastica sono preferibili durante la reazione, in quanto unore più facile da rimuovere dalla sezione.

Riferimenti

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