Un modo semplice, efficace e robusto per sincronizzare l'erogazione di più componenti virali di cellule vegetali tramite Agrobacterium-Mediata espressione transiente è descritto. Questo approccio è suscettibile per studiare la replicazione, seguita da incapsidamento In vitro Riassemblaggio di non virali componenti nel genoma impoverito ottici fantasmi virali adatti per applicazioni biomediche.
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Articolo metodologico
Semplice e robusta In vivo E In vitro per lo Studio Assemblea Virus
In questo articolo
Sommario
Abstract
In positivo-virus con RNA genomi senso patogeno per gli esseri umani, animali e piante, incapsidazione progenie in virioni maturi e stabili è una fase cardinale durante la creazione di infezione in un determinato host. Di conseguenza, lo studio delle incapsidazione decifra le informazioni riguardanti il know-how del meccanismo di regolazione di assemblaggio del virus per formare virioni infettivi. Tale informazione è di vitale importanza nella formulazione di nuovi metodi di arginare diffusione del virus e il controllo delle malattie. Incapsidamento Virus possono essere studiati in vivo e in vitro. Incapsidazione Genoma in vivo è un processo altamente regolato selettiva che le interazioni macromolecolari e compartimentazione subcellulare. Pertanto, lo studio porta a sezionare gli eventi che comprendono incapsidazione virus in vivo avrebbe fornito le conoscenze di base per comprendere come i virus proliferano e assemblare. Recentemente incapsidazione in vitro è stata sfruttata per la ricerca nel campo della biomedica imaging e applicazioni terapeutiche. Non capsulati virus delle piante stanno molto più avanti nella joint venture di incapsidazione in vitro del materiale caricato negativamente straniera. Virus del mosaico Brome (BMV), privi di involucro multicomponente RNA virus patogeno per le piante, è stato utilizzato come sistema modello per lo studio confezionamento genoma in vivo e in vitro. Per i saggi di incapsidamento in Nicotiana benthamiana, mediata da Agrobacterium espressione transiente, si riferiscono come agroinfiltration, è una tecnica efficiente e robusto per la consegna sincronizzata e l'espressione di più componenti alla stessa cella. In questo approccio, una sospensione di cellule di Agrobacterium tumefaciens che trasportano binari vettori plasmidici che trasportano cDNA di mRNA desiredviral è infiltrata nella foglia spazio intercellulare withina utilizzando niente di più sofisticato di una siringa monouso da 1 ml (senza ago). Questo processo determina il trasferimento di inserto di DNA nelle cellule vegetali, il T-DNAInserto rimane transitoriamente nel nucleo e viene quindi trascritto dall'host polimerasi II, con conseguente espressione transiente. La trascrizione mRNA risultante (livellata e poliadenilato) viene poi esportato nel citoplasma per la traduzione. Dopo circa 24 a 48 ore di incubazione, sezioni di foglie infiltrati possono essere prelevati per le analisi biochimiche microscopyor. Agroinfiltration permette grandi numeri (centinaia di migliaia) di cellule trasfettate da simultaneamente. Per incapsidazione in vitro, virioni purificati di BMV sono dissociate in proteina del capside di dialisi contro tampone di cloruro di calcio dissociazione contenente seguita dalla rimozione di RNA e non-virioni dissociate mediante centrifugazione. Genome subunità proteiche del capside impoverito vengono poi riassemblati con desiderati componenti del genoma virale o non virale componenti come indocianina colorante.
Protocollo
1. Materiale vegetale
- Nicotiana benthamiana da utilizzare nel saggio incapsidamento dovrebbe essere a 4 fase foglie (piante settimane circa 3-4 anni).
2. La consegna e l'espressione di componenti funzionali del genoma virale di piantare cellule agroinfiltration
- Giorno 1: Il ceppo di Agrobacterium (es. EH 105 o GV 3101) ospitante il pCass BMV-1 RNA, RNA BMV 2 e 3 1,2 BMV RNA sono coltivate su piastre di agar LB integrato con 50 mg / ml di kanamicina (seleziona per il vettore pCASS) e 100mg/ml di rifampicina (seleziona per l'Agrobacterium). L'incubazione viene effe....
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Discussione
Agroinfiltration approccio qui presentate può essere ampiamente applicabile a un'ampia gamma di virus vegetali. Un elemento caratterizzante di questo approccio è sincronizzata consegna di molteplici agroconstruct alla stessa cella, un grave inconveniente comunemente associato solitamente usata inoculazione meccanica di virus vegetali. In vivo e in vitro studi di assemblaggio utilizzando virus del mosaico del bromo come modello può essere condotto in modo efficiente seguono alcuni suggerimenti. (i) .......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare alcuni membri del laboratorio per i loro preziosi suggerimenti per lo sviluppo di agroinfiltration di assemblaggio e test in vitro. Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di studio presso la University of California. Questo studio è stato sostenuto in parte da un finanziamento della National Science Foundation (cbet-1144237).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | |
| MES sali di sodio | Sigma-Aldrich | M2993 | |
| Verde di indocianina | Sigma-Aldrich | I2633 | |
| Beckman ultracentrifuga | Beckman Coulter | Modello: L8-70M | |
| Centricon-100 colonna | Millipore | YM-100 | |
| Spettrofotometro | Cary 50, Varian Inc. | Codice 10068900 | |
| Spettrofluorimetro | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | Codice FL3-21 |
Riferimenti
- Annamalai, P., Rao, A. L. Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging. Virology. 338, 96-111 (2005).
- Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L.
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Ristampe e permessi
