Murine trapianto di midollo osseo è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi immunologici che regolano graft-versus-host disease negli esseri umani. La capacità di monitorare il traffico delle cellule T modelli In vivo Consente per l'analisi dettagliata dello sviluppo e la perpetuazione delle risposte delle cellule T durante la graft-versus-host disease.
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Articolo metodologico
Induzione di Graft-versus-host disease e
In questo articolo
Sommario
Abstract
Graft-versus-host disease (GVHD) è la barriera che limita l'ampio utilizzo di trapianto di midollo osseo come terapia curativa per una serie di carenze ematologiche. GVHD è causata da cellule T mature alloreattive presenti nel trapianto midollo osseo che sono infuse nel ricevente e causare danni agli organi di accoglienza. Tuttavia, nei topi, cellule T deve essere aggiunto al inoculo midollo osseo a causare GVHD. Sebbene un ampio lavoro è stato fatto per caratterizzare le risposte delle cellule T dopo trapianto, bioluminescente tecnologia di imaging è un metodo non invasivo per monitorare il traffico delle cellule T modelli in vivo.
A seguito di irradiazione letale, topi riceventi sono trapiantati con cellule del midollo osseo e splenociti di topi donatori. Sottopopolazioni di cellule T da L2G85.B6 (topi transgenici che esprimono costitutivamente luciferasi) sono incluse nel trapianto. Da trapiantare solo alcune sottopopolazioni di cellule T, è in grado di monitorare specifici sottogruppi di cellule T in vivo,e in base alla loro posizione, sviluppare ipotesi sul ruolo di specifici sottogruppi di cellule T nel promuovere la GVHD in vari momenti. A intervalli predeterminati dopo il trapianto, topi riceventi vengono esposte con una Xenogen IVIS camera CCD. L'intensità della luce può essere quantificato utilizzando il software Image Vivere per generare una pseudo-immagine a colori in base all'intensità fotone (rosso = alta intensità, viola intensità = bassa).
Tra 4-7 dopo il trapianto giorni, topi riceventi cominciano a mostrare segni clinici di GVHD. Cooke et al. 1 messo a punto un sistema di valutazione per quantificare la progressione della malattia in base al destinatario pelliccia trama topi, l'integrità della pelle, attività, perdita di peso, e la postura. I topi sono segnati tutti i giorni, e l'eutanasia quando diventano moribondi. Topi riceventi diventano in genere moribondo 20-30 giorni dopo il trapianto.
Modelli murini sono strumenti preziosi per lo studio della immunologia di GVHD. Selettivamente il trapianto delle cellule T sottoinsiemi particolare alminimi per l'identificazione accurata dei ruoli ogni sottoinsieme gioca. Non invasivo di monitoraggio risposte delle cellule T in vivo aggiunge un ulteriore livello di valore per i modelli murini GVHD.
Protocollo
1. Irradiazione letale
- Inserire fino a 10 topi riceventi in una gabbia microisolator compatibile con l'irradiatore da utilizzare.
- Irradiare in 2 dosi uguali sommatori dose totale (dose totale = 9 cGy per i destinatari BALB.B). Irraggiamento secondo dovrebbe essere di 3 ore dopo la prima. L'iniezione deve avvenire tra 4-6 ore dopo l'irradiazione finale. Topi irradiano in entrambi 137 sorgente Cs o RS2, 000, irradiatore.
- Dopo la seconda dose di radiazioni, i topi in gabbia negozio microisolator con acqua acidificata fino al momento del trapianto.
2. Preparazione Splenocyte
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Discussione
Il protocollo per indurre GVHD nei topi qui presentato rappresenta un modello clinicamente rilevante di GVHD murino. Fondato da Berger et al. Nel 1994, il C57Bl / 6 in combinazione ceppo BALB.B è MHC-abbinato, con una mortalità GVHD mediata da CD4, CD8 dipendenti effettori T 2, molto simili allo scenario clinico più comune 3. E 'noto che trapiantando cellule T CD8 sola non causa GVHD in questo modello, tuttavia, la progressione della malattia è significativamente peggiore quando sia CD.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Siamo in debito con Alice Gaughan e-Jiao Jing Wang cui eccellente supporto tecnico, apporto intellettuale, e sostegno morale hanno contribuito a spostare in avanti questi studi. Questi studi sono stati sostenuti dalla concessione NIH AI036532 a GAH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 12633-012 | |
| Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10439016 | |
| 40 Filtro Cella pM | BD Biosciences | 352340 | |
| CD3e-Biotina | Miltenyi Biotech | 130-093-021 | |
| Anti-biotina Microsfere | Miltenyi Biotech | 130-091-147 | |
| CD8a Microsfere | Miltenyi Biotech | 130-049-401 | Utilizzato per esaurire le cellule T CD8 da milza. |
| CD8a Purificazione cocktail di anticorpi | Miltenyi Biotech | 130-095-236 | Usato per purificareCellule T CD8 di milza. |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences | 122796 |
Riferimenti
- Cooke, K. R. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Berger, M.
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Ristampe e permessi
