Recentemente high-throughput tecnologia di sequenziamento ha notevolmente aumentato la sensibilità di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) esperimento e ha spinto la sua applicazione con cellule purificate o tessuti sezionati. Qui delineare un metodo per usare la tecnica ChIP con Drosophila Tessuto, che può definire la condizione cromatina endogeno in un sistema ben caratterizzato biologico.
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Articolo metodologico
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con Drosophila Tessuto
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'epigenetica rimane un settore in rapida evoluzione che gli studi come lo stato della cromatina contribuisce alla espressione genica differenziale in diversi tipi di cellule a diversi stadi di sviluppo. Regolazione epigenetica contribuisce ad un ampio spettro di processi biologici, tra cui la differenziazione cellulare durante lo sviluppo embrionale e l'omeostasi in età adulta. Una strategia critico negli studi epigenetici è quello di esaminare come le varie modificazioni degli istoni e fattori di cromatina regolare l'espressione genica. Per risolvere questo problema, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è ampiamente utilizzato per ottenere una fotografia della associazione di fattori particolari con DNA nelle cellule di interesse.
ChIP tecnica utilizza comunemente cellule coltivate come materiale di partenza, che può essere ottenuto in abbondanza e omogeneità per generare dati riproducibili. Tuttavia, vi sono diversi avvertimenti: Innanzitutto, l'ambiente far crescere le cellule in piastre di Petri è diversa da quella in vivo, così puònon rispecchiano lo stato endogena cromatina delle cellule in un organismo vivente. In secondo luogo, non tutti i tipi di cellule possono essere coltivate ex vivo. Ci sono solo un numero limitato di linee cellulari, da cui la gente può ottenere abbastanza materiale per l'analisi ChIP.
Qui si descrive un metodo per fare esperimenti ChIP utilizzando tessuti di Drosophila. Il materiale di partenza è sezionato da un tessuto animale vivente, quindi in grado di rispecchiare con precisione lo stato endogena cromatina. L'adattabilità di questo metodo con diversi tipi di tessuto permetterà ai ricercatori di affrontare molto più biologicamente questioni rilevanti in materia di regolazione epigenetica in vivo 1, 2. Combinando questo metodo con high-throughput sequencing (ChIP-seq) ulteriormente permetterà ai ricercatori di ottenere un paesaggio epigenomic.
Protocollo
(La procedura intero chip richiede circa due giorni. Preparazione di librerie di chip per alta sequenziamento richiede altri 2-3 giorni.)
1. Sezionare e prepara il tessuto per Experiment ChIP (circa 1 milione di cellule)
- Dissect tessuto di interesse (ad esempio, 200 paia di Drosophila testicoli) in PBS freddo inibitore della proteasi + 1x (sciogliere 1 pellet di cocktail inibitore della proteasi in 1,5 ml di PBS 1x a 7x ottenendo così la soluzione stock) + PMSF (concentrazione finale 100 pg / mL). Risciacquare tessuto doppio tessuto e risospendere in 200 pl della stessa soluzione di PBS con inibitori. ....
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Discussione
La versatilità di analisi ChIP discussi in questo protocollo può essere utilizzato su diversi tessuti, che fornisce l'opportunità di studiare lo stato cromatina in un sistema biologicamente rilevante. Esperimenti chip utilizzando cellule coltivate sono sistemi conveniente eseguire a causa grande quantità di cellule può essere ottenuto facilmente. Tuttavia, cellule coltivate non riflette necessariamente cellule in un multi-cellulare ambiente. Con lo sviluppo di questa tecnica usando tessuti sezionati da animali vivi,.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Keji Zhao lab (NIH / NHLBI) per il loro aiuto nel fornire i risultati di sequenziamento. Vorremmo anche ringraziare il progetto genoma UCSC per l'utilizzo di Browser per visualizzare sequenziamento del genoma mappato legge.
Questo lavoro è stato sostenuto dal Pathway R00HD055052 NIH al Premio Indipendenza e R01HD065816 dal NICHD, il Lucile Parkard Foundation, e la Johns Hopkins University di start-up fondi per XC
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Complete Mini cocktail inibitore della proteasi | Roche | 11836153001 | |
| La formaldeide (37%) | Supelco | 47.083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellet pestello | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Poliacrilammide lineare | Sigma | 56575-1 ml | |
| Glicogeno | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green / ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini Piastra filatrice | Labnet | Z723533 | |
| Real time PCR System | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Volume piccolo processore ad ultrasuoni | Misonix | HS-XL2000 | Modello interrotto |
| Dynabeads, Proteina A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnete | Invitrogen | 123-21D | |
| Fenolo: Chlorofrom: IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotecnologie | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3 '→ 5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| DNA ligasi T4 | Promega Corporation | M1794 | |
| Adattatore oligonucleotidi | Illumina | PE-400-1001 | |
| Abbinato-End Primer 1.0 e 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 | |
| E-Gel Electorphoresis sistema | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
Riferimenti
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B.
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Ristampe e permessi
