L'obiettivo generale di questo video è quello di mostrare come eseguire l'iniezione mirata della retina e In ovo del DNA / RNA costrutti nella retina pulcino embrionale alla Hamburger e lo stadio Hamilton 22-23, che è di circa 4 giorni embrionale (E4). Questa tecnica è molto utile per studio dell'espressione genica, regolazione genica, e cambiamento morfologico in sviluppo retina pulcino.
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Articolo metodologico
In elettroporazione Ovo in Retina Chick Embryonic
In questo articolo
Sommario
Abstract
Retina embrionale di pollo è un ottimo strumento per studiare lo sviluppo della retina nei vertebrati superiori. Causa delle grandi dimensioni e sviluppo esterna, è comparativamente molto facile manipolare la retina embrionale pulcino usando ricombinante DNA / tecnologia RNA. Elettroporazione del DNA / RNA costrutti nella retina embrionale hanno un grande vantaggio per lo studio della retina regolazione genica in cellule staminali / progenitrici durante lo sviluppo della retina. Diverso tipo di saggi quali saggio gene reporter, genica sovra-espressione, gene abbattere (shRNA) ecc può essere eseguita utilizzando la tecnica elettroporazione. Questo video dimostra l'iniezione mirata della retina e in elettroporazione ovo nella retina pulcino embrionale alla Hamburger e Hamilton fase di 22-23, che è di circa 4 giorni embrionale (E4). Qui mostriamo una rapida e conveniente in tecnica elettroporazione ovo quale un DNA plasmide che esprime proteina verde fluorescente (GFP) come marcatore viene consegnato direttamente nelpulcino embrionale spazio sottoretinico e seguiti da impulsi elettrici per facilitare l'assorbimento del DNA da parte della retina cellule staminali / progenitrici. Il nuovo metodo di iniezione retinica ed elettroporazione presso E4 permette la visualizzazione di tutti i tipi di cellule retiniche, compreso il tardo-nato neuroni 1, che è stato difficile con il metodo convenzionale di iniezione ed elettroporazione a E1.5 2.
Protocollo
Poiché alcune parti del protocollo vengono eseguiti come precedentemente descritto in altri video Jové 2 e testi 3 con modifica minore non parleremo quelli in dettaglio qui.
1. Egg manipolazione e preparazione Needle
- Le uova possono essere memorizzati in un wine cooler a circa 13 ° C per fino a 1 settimana. Se la temperatura è troppo alta, embrioni inizierà a sviluppare anormalmente, mentre più bassa temperatura provoca mortalità elevata. Una volta che siete pronti ad incubare togliere le uova dal raffreddamento di vino e impostare le uova in posizione verticale con l'estremità più grande up. Conservare le uova della temperatura ambiente per almeno 2 ore prima di metterli nel 37.5 ° C incubatore.
- Incubare le uova per 96-100 ore che è di circa 4 giorni embrionali per ottenere gli embrioni che sono alla Hamburger e lo stadio Hamilton 22 4-5.
- Preparare aghi micropipette da tubi di vetro tirato capillari e rompere la punta sotto un micro dissezionecampo di applicazione con una pinzetta per ottenere una apertura punta circa 0,1 micron di diametro e un cono 20 mm. Aghi con le grandi punte hanno difficoltà a perforare la membrana vitellina mentre i più piccoli hanno difficoltà a punte di carico e fornire la soluzione di DNA.
- Applicare l'ago da ml 0,1 siringhe Hamilton a tenuta di gas montato su un micromanipolatore. Usare un piccolo pezzo di tubo in silicone Masterplex per attaccare l'ago alla siringa. Dal momento che i collegamenti siano saldi non c'è bisogno di aggiungere olio minerale per suggellare questo allegato.
- Mix 2 pl di soluzione di DNA plasmide reporter con una concentrazione compresa 3-6 ug / pl e 0,2 pl di verde veloce (0,025%) su un pezzo di parafilm. Veloce colorante verde aiuterà a visualizzare l'iniezione. Lentamente, caricare l'ago con la miscela.
- Per liberare la membrana vitellina dalla membrana interna ruotare delicatamente l'uovo circa 180 ° e attendere per qualche minuto quindi ruotarlo in posizione originale e impostarlo per l'elettroporazione.
- Pulire la forceps e guscio d'uovo con il 70% di etanolo per evitare l'infezione per l'embrione.
- Fare un piccolo foro sul l'uovo immediatamente sopra la cella aria con un paio di dimensioni pinze AA. Fare attenzione a non rompere il guscio dell'uovo. Rimuovere piccoli pezzi uno alla volta per fare una piccola finestra. Rimuovere con cura la membrana interna utilizzando le pinze, senza toccare la membrana vitellina.
2. Iniezione ed elettroporazione
- Per evitare danni al cervello o, il cuore della posizione di contra 'ago lateralmente al fascio principale dei vasi sanguigni che entrano l'occhio e rivolta verso il becco.
- Pierce attraverso la membrana vitellina, sclera, retina e vitreo da una spinta improvvisa lieve dell'ago. Se l'ago perfora attraverso l'altra estremità dell'occhio essa dovrebbe essere alright meno che non danneggia qualsiasi vena principale sangue.
- Tiri indietro lentamente lo dell'ago al bordo dell'apertura e posizionarlo quasi tangente alla parete esterna del bulbo oculare.
- Insert l'ago nello spazio sub retinica tra la sclera e retina.
- Iniettare il DNA finché non sarà possibile visualizzare la soluzione verde riempire il lato del bulbo oculare e spingendo verso l'interno della retina creando un rigonfiamento.
- Se la vostra collocazione dell'ago non è corretta allora vedrete la soluzione di DNA diffusione all'interno del vitreo riempire il centro del bulbo oculare. Inoltre, se si danneggiare la retina troppo allora vedrete la soluzione di DNA è venuta fuori del bulbo oculare.
- Rimuovere lentamente l'ago e porre immediatamente gli elettrodi in parallelo dentro l'uovo dopo l'immersione in PBS. Spingere verso il basso gli elettrodi di immergerci il liquido amniotico in un modo in modo che l'occhio iniettato si trova tra gli elettrodi. Evitare di toccare qualsiasi nave importante il sangue o il cuore con gli elettrodi, mentre per questi ultimi. L'elettrodo negativo dovrebbe essere al lato iniezione in modo che il DNA può essere trasportato da sub spazio retinica nella retina verso elettrodo positivo. Electroincorporare l'retina con 5 impulsi di 15V per 50 ms, con intervalli di 950 ms.
- Rimuovere con cura gli elettrodi e sigillare la finestra delle uova con pezzi di nastro adesivo trasparente.
- Etichetta e data l'uovo iniettato prima di riporlo per l'incubatrice. Tipicamente, ci vogliono circa 3 a 5 minuti per completare l'intero processo elettroporazione.
- Espressione GFP può essere visto come precoce da 8 ore dalla elettroporazione. Tuttavia, è possibile attendere che l'embrione raggiunge lo stadio desiderato prima della raccolta.
3. Risultati rappresentativi
Nel nostro studio, usiamo vari costrutti plasmidici per studiare la regolazione dell'espressione genica che ha coinvolto lo sviluppo delle cellule della retina. In questo video pCAG-GFP (controllo trasfezione) è stato usato per seguire una iniezione di successo e elettroporazione. Tuttavia, qualsiasi costrutto plasmidico con gene reporter (GFP, RFP ecc) può essere utilizzato. Anche se l'espressione GFP può essere visto a partire da 8 ore dopo l'electroporation, di solito la raccolta inizia l'uovo il giorno 6 (E6) e poi. Elettroporate retine sono stati sezionati fuori dell'embrione e analizzato al microscopio a fluorescenza dissezione prima di incasso e di sezionamento. Tipicamente, espressione genica reporter può essere visto almeno in un quarto della retina dopo una elettroporazione di successo (Fig. 1). I tessuti della retina transfettate sono stati ulteriormente analizzati attraverso il sezionamento per la visualizzazione chiara delle morfologie cellulari. Immunoistochimica utilizzando marcatori di tipo specifico di cellule (Brn3a, Pax6 ecc) ha permesso la caratterizzazione delle cellule GFP-specifica espressione (Fig. 2).
Figura 1. Elettroporazione successo di plasmide reporter GFP risultati positivi. Pollo embrionale retine sono state iniettate ed elettroporati al giorno embrionale 4 e raccolte al giorno embrionale 6. Almeno il 25% della retina con successo trasfettata (A = Vista dall'alto, B= Vista dal basso). Scale Bar = 1mm.
Figura 2. Caratterizzazione di GFP esprimere cellule della retina mediante immunoistochimica. GFP esprimere tessuti retinici in fase E7 sono stati fissati e sezionati. Queste sezioni sono state poi colorate con vari marcatori cellulari specifici. Brn3a è stato utilizzato per determinare cellule gangliari (A), mentre Pax6 è stato utilizzato per determinare orizzontali, amacrine e le cellule gangliari (B). Scala bar = 50 micron.
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Discussione
L'iniezione mirata della retina e in elettroporazione ovo in retina embrionale allo stadio E4 possono specificatamente colpire le cellule progenitrici della retina conseguente la capacità di visualizzare tutti e sei i principali tipi di cellule della retina a livello di singola cellula. In elettroporazione ovo a HH10 (~ E1.5) rivolte alla vescicola ottica è in grado di trasfettare cellule che si sviluppano a formare l'occhio. Tuttavia, queste cellule hanno un fatturato molto e...
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Dichiarazioni
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Animal Care Comitato Istituzionale e Servizi alla Rutgers University.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Sig. Maaz Enver per l'utilizzo della sua macchina fotografica HD (Cannon VIXIA HFS100). Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal NIH (EY018738), New Jersey Commissione per la ricerca del Midollo Spinale (08-3074-SCR-E-0 e 10-3091-SCR-E-0), e Busch Award Ricerca Biomedica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Fecondate esenti da organismi patogeni (SPF) Leghorn Bianco di pollo uova | Farms Sunrise (Catskill, NY) | ||
| Incubatrice per uova di pollo | GQF produzione, Savannah, GA | Modello-1550 | Imposta al 60% di umidità e 37,5 ° C. |
| Tubi di vetro capillari | Mondiale Precision Instrument Inc. | TW150F-4 | |
| 0,1 ml siringa | Hamilton Co. Reno, Nevada | A tenuta di gas 1710 | Siringa alternativa 1ml può essere utilizzato come pure |
| Masterflex Silicone (perossido) Tubi | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Tagliare un pezzetto (1 cm) per fissare l'ago alla siringa di vetro |
| Pinzetta | Dumont | AA | |
| Micromanipolatore | Mondiale Precision Instrument Inc. | M3301-M3 | |
| DNA plasmidico | pCAG-GFP è stato preso in prestito dal Dr. Connie Cepko | ||
| Verde fast FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Diluire al 0,025% con PBS |
| Generatore di impulsi | Harvard Apparatus, MA | BTX ECM 830 | Generatore di onda quadra |
| Elettrodi | Harvard Apparatus, MA | BTX modello 514 | I nostri elettrodi sono stati distanziati 3-5 mm l'uno dall'altro |
| Fotocamera digitale monocromatica | Zeiss, Germania | Axiocam MRM | |
| Dissezione microscopio a fluorescenza | Leica Microsystems, Germania | Leica MZ16FA | |
| Upright microscopio a fluorescenza | Zeiss, Germania | Zeiss Axio Imager A1 |
Riferimenti
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
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Ristampe e permessi
