L'obiettivo generale di questo video è quello di mostrare come eseguire l'iniezione mirata della retina e In ovo del DNA / RNA costrutti nella retina pulcino embrionale alla Hamburger e lo stadio Hamilton 22-23, che è di circa 4 giorni embrionale (E4). Questa tecnica è molto utile per studio dell'espressione genica, regolazione genica, e cambiamento morfologico in sviluppo retina pulcino.
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Articolo metodologico
In elettroporazione Ovo in Retina Chick Embryonic
In questo articolo
Sommario
Abstract
Retina embrionale di pollo è un ottimo strumento per studiare lo sviluppo della retina nei vertebrati superiori. Causa delle grandi dimensioni e sviluppo esterna, è comparativamente molto facile manipolare la retina embrionale pulcino usando ricombinante DNA / tecnologia RNA. Elettroporazione del DNA / RNA costrutti nella retina embrionale hanno un grande vantaggio per lo studio della retina regolazione genica in cellule staminali / progenitrici durante lo sviluppo della retina. Diverso tipo di saggi quali saggio gene reporter, genica sovra-espressione, gene abbattere (shRNA) ecc può essere eseguita utilizzando la tecnica elettroporazione. Questo video dimostra l'iniezione mirata della retina e in elettroporazione ovo nella retina pulcino embrionale alla Hamburger e Hamilton fase di 22-23, che è di circa 4 giorni embrionale (E4). Qui mostriamo una rapida e conveniente in tecnica elettroporazione ovo quale un DNA plasmide che esprime proteina verde fluorescente (GFP) come marcatore viene consegnato direttamente nelpulcino embrionale spazio sottoretinico e seguiti da impulsi elettrici per facilitare l'assorbimento del DNA da parte della retina cellule staminali / progenitrici. Il nuovo metodo di iniezione retinica ed elettroporazione presso E4 permette la visualizzazione di tutti i tipi di cellule retiniche, compreso il tardo-nato neuroni 1, che è stato difficile con il metodo convenzionale di iniezione ed elettroporazione a E1.5 2.
Protocollo
Poiché alcune parti del protocollo vengono eseguiti come precedentemente descritto in altri video Jové 2 e testi 3 con modifica minore non parleremo quelli in dettaglio qui.
1. Egg manipolazione e preparazione Needle
- Le uova possono essere memorizzati in un wine cooler a circa 13 ° C per fino a 1 settimana. Se la temperatura è troppo alta, embrioni inizierà a sviluppare anormalmente, mentre più bassa temperatura provoca mortalità elevata. Una volta che siete pronti ad incubare togliere le uova dal raffreddamento di vino e impostare le uova in posizione verticale con l'estremità più grande up. Conservar....
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Discussione
L'iniezione mirata della retina e in elettroporazione ovo in retina embrionale allo stadio E4 possono specificatamente colpire le cellule progenitrici della retina conseguente la capacità di visualizzare tutti e sei i principali tipi di cellule della retina a livello di singola cellula. In elettroporazione ovo a HH10 (~ E1.5) rivolte alla vescicola ottica è in grado di trasfettare cellule che si sviluppano a formare l'occhio. Tuttavia, queste cellule hanno un fatturato molto e.......
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Dichiarazioni
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Animal Care Comitato Istituzionale e Servizi alla Rutgers University.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Sig. Maaz Enver per l'utilizzo della sua macchina fotografica HD (Cannon VIXIA HFS100). Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal NIH (EY018738), New Jersey Commissione per la ricerca del Midollo Spinale (08-3074-SCR-E-0 e 10-3091-SCR-E-0), e Busch Award Ricerca Biomedica.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Fecondate esenti da organismi patogeni (SPF) Leghorn Bianco di pollo uova | Farms Sunrise (Catskill, NY) | ||
| Incubatrice per uova di pollo | GQF produzione, Savannah, GA | Modello-1550 | Imposta al 60% di umidità e 37,5 ° C. |
| Tubi di vetro capillari | Mondiale Precision Instrument Inc. | TW150F-4 | |
| 0,1 ml siringa | Hamilton Co. Reno, Nevada | A tenuta di gas 1710 | Siringa alternativa 1ml può essere utilizzato come pure |
| Masterflex Silicone (perossido) Tubi | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Tagliare un pezzetto (1 cm) per fissare l'ago alla siringa di vetro |
| Pinzetta | Dumont | AA | |
| Micromanipolatore | Mondiale Precision Instrument Inc. | M3301-M3 | |
| DNA plasmidico | pCAG-GFP è stato preso in prestito dal Dr. Connie Cepko | ||
| Verde fast FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Diluire al 0,025% con PBS |
| Generatore di impulsi | Harvard Apparatus, MA | BTX ECM 830 | Generatore di onda quadra |
| Elettrodi | Harvard Apparatus, MA | BTX modello 514 | I nostri elettrodi sono stati distanziati 3-5 mm l'uno dall'altro |
| Fotocamera digitale monocromatica | Zeiss, Germania | Axiocam MRM | |
| Dissezione microscopio a fluorescenza | Leica Microsystems, Germania | Leica MZ16FA | |
| Upright microscopio a fluorescenza | Zeiss, Germania | Zeiss Axio Imager A1 |
Riferimenti
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Emb....
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Ristampe e permessi
