Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso

Sommario

Biofilm microbici sono generalmente costituiti da distinti sottopopolazioni di cellule specializzate. Cella singola analisi di queste sottopopolazioni richiede l'uso di reporter fluorescenti. Qui descriviamo un protocollo di visualizzare e monitorare diversi subpopulationswithin B. subtilis Biofilm mediante microscopia a fluorescenza e citometria a flusso.

Abstract

Formazione di biofilm è un attributo per quasi tutti i batteri ^1-6. Quando batteri formano biofilm, le cellule sono racchiusi nella matrice extracellulare che è prevalentemente costituito da proteine ​​e esopolisaccaridi, tra gli altri fattori ^7-10. La comunità microbica racchiuso all'interno del biofilm spesso mostra la differenziazione della distinta sottopopolazione di cellule specializzate ^11-17. Queste sottopopolazioni coesistono e spesso mostrano organizzazione spaziale e temporale all'interno del biofilm ^18-21.

Formazione di biofilm nel modello Bacillus subtilis richiede la differenziazione delle sottopopolazioni di cellule specializzate distinte. Tra questi, la sottopopolazione di produttori matrice, responsabili di produrre e secernere la matrice extracellulare del biofilm è essenziale per la formazione di biofilm ^11,19. Pertanto, la differenziazione dei produttori matrice è una caratteristica della formazione di biofilm in B. subtilis.

Abbiamo usato giornalisti fluorescenti per visualizzare e quantificare la sottopopolazione di produttori matrice in biofilm di B. subtilis ^15,19,22-24. Concretamente, abbiamo osservato che la sottopopolazione di produttori matrice differenzia in risposta alla presenza di autoprodotto segnale extracellulare surfattina ^25. È interessante notare, surfattina è prodotto da una sottopopolazione di cellule specializzate diverse dalla sottopopolazione di produttori matrice ^15.

Abbiamo riportato in questa relazione l'approccio tecnico necessario per visualizzare e quantificare la sottopopolazione dei produttori e dei produttori matrice surfattina nei biofilm di B. subtilis. Per fare questo, reporter fluorescenti di geni necessari per la produzione di matrice e di produzione di surfattina sono inseriti nel cromosoma di B. subtilis. Reporter sono espressi solo in una sottopopolazione di cellule specializzate. Quindi, le sottopopolazioni possono esseremonitorata utilizzando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso (Fig. 1).

Il fatto che diverse sottopopolazioni di cellule specializzate coesistono all'interno delle comunità multicellulari di batteri ci dà una prospettiva diversa sulla regolazione dell'espressione genica nei procarioti. Questo protocollo affronta questo fenomeno sperimentalmente e può essere facilmente adattato a qualsiasi modello di altre lavorazioni, per chiarire i meccanismi molecolari alla base eterogeneità fenotipica all'interno di una comunità microbica.

Protocollo

1. Etichettatura B. subtilis e formazione di analisi Biofilm

1. Amplificazione PCR dalla regione del promotore del gene di interesse. Si mostra come esempio la clonazione di P _tapa, il promotore dei geni responsabili per la produzione di proteina Tasa matrice ^26. Clone P _tapa in pkm008 vettore (creato dal laboratorio di Rudner, Harvard Medical School. Boston, USA) (Fig. 2).
2. Linearizzare i plasmidi per digestione enzimatica (Enzyme consigliato, XhoI).
3. Indurre la competenza naturale in B. subtilis ceppo 168 seguendo il one-step protocollo precedentemente descritto da Harwoo....

Discussione

Il fatto che le comunità batteriche mostrano sottopopolazioni di cellule che esprimono set specifico di geni evidenzia la complessità delle comunità microbiche ^33,34. Questo protocollo dovrebbe aiutare a determinare se l'espressione di un gene di interesse viene limitata a un particolare sottopopolazione di cellule specializzate nella comunità microbica. Visualizzazione di tali sottopopolazioni richiede lo sviluppo di nuove tecniche, perché i metodi tradizionali per monitorare l'espressione genica o a.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tecnica	Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo
MSgg composizione	fosfato di potassio 5mM	Roth	6878
100 mM MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
Cloruro di magnesio 2 mM	Roth	2.189,1
Cloruro di calcio 700μM	Roth	A119.1
50 micron cloruro ferrico	Sigma-Aldrich	157740
Cloruro di zinco 1 pm	Applichem	A2076
Tiamina 2μM	Sigma-Aldrich	74625
Glicerolo 0,5%	Roth	7533
Glutacompagno di 0,5%	Sigma-Aldrich	49621
Triptofano 50μg/ml	Sigma-Aldrich	T0254
Fenilalanina 50μg/ml	Sigma-Aldrich	P2126
Cella di fissaggio	Paraformaldeide	Roth	0335
	Nome dell'apparecchiatura	Azienda	Numero di catalogo
Sonicazione	Cella Sonicator	Bandelin	D-1000
Microscopia a fluorescenza	Microscopio a fluorescenza	Leica	DMI6000B
	Nome del software	Azienda	Numero di catalogo
Microscopia a fluorescenza	Asaf	Leica
Citometria a flusso	FCASDiva	BD
Citometria a flusso	FlowJo	Treestar