Dimostriamo FRET tra polydiacetylene polimero coniugato (PDA) e fluoroforo attaccato alla superficie dei liposomi mobile per il rilevamento di biomolecole. Liposomi PDA conteneva anche molecole recettoriali sulle loro superfici di biomolecole da utilizzare come sonde. Interazioni ligando-recettore portare a cambiamenti nella FRET efficienza tra il fluoroforo e PDA che è alla base del meccanismo di rilevamento.
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Articolo metodologico
Monitoraggio in tempo reale delle interazioni ligando-recettore mediante Bonifico Fluorescence Resonance Energy
In questo articolo
Sommario
Abstract
FRET è un processo in cui l'energia non è radiativamente trasferita da una molecola donatrice eccitato ad un stato fondamentale molecola accettore a lungo raggio attraverso interazioni dipolo-dipolo 1. Nel saggio di rilevamento presente, utilizziamo una proprietà interessante di PDA: blu-shift in UV-Vis spettro di assorbimento elettronica PDA (figura 1) dopo un analita interagisce con i recettori collegati al PDA 2,3,4,7. Questo spostamento nello spettro di assorbimento PDA fornisce cambiamenti nelle sovrapposizione spettrale (J) tra PDA (accettore) e rodamina (donatore) che porta a variazioni del FRET efficienza. Pertanto, le interazioni tra analita (ligando) e recettori vengono rilevati tramite FRET tra fluorofori donatori e PDA. In particolare, ci mostra il rilevamento di un modello di streptavidina molecola proteica. Abbiamo inoltre dimostrato il legame covalente-di albumina di siero bovino (BSA) alla superficie del liposoma con FRET meccanismo. Queste interazioni tra tegli liposomi bistrato e molecole proteiche possono essere rilevati in tempo reale. Il metodo proposto è un metodo generale per il rilevamento chimico piccole e grandi molecole biochimiche. Poiché fluorescenza è intrinsecamente più sensibile colorimetria, il limite di rilevazione del test può essere in sub-nanomolare gamma o inferiore 8. Inoltre, PDA può agire come accettore universale FRET, il che significa che più sensori possono essere sviluppati con PDA (accettore) funzionalizzato con donatori e recettori diversi attribuiti sulla superficie dei liposomi PDA.
Protocollo
A. Sintesi e caratterizzazione di liposomi PDA 4,5,6
Nota 1: Proteggere la soluzione dalla luce PDA utilizzando foglio di imballaggio di alluminio su ogni contenitore in tutte le fasi sperimentali.
Nota 2: Due insiemi diversi di soluzione liposomi (B e C) sono stati preparati seguente procedura A (Sintesi e caratterizzazione di liposomi PDA).
1. Sintesi di N-idrossisuccinimmide Diacteylene (NHS-PCDA)
- Per preparare liposomi, un ingrediente essenziale PCDA-NHS è necessaria. Abbiamo sintetizzato PCDA-NHS utilizzando la seguente procedura:
- Aggiungere acido ....
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Discussione
Abbiamo effettuato legame selettivo di residuo di lisina della proteina sulla superficie del liposoma con NHS-ammina reazione. Questo metodo basato FRET è capace di fare monitoraggio in tempo reale di biotina-streptavidina vincolanti e proteine (BSA) di legame alla superficie del liposoma. Analoga procedura può essere applicata per studiare la dinamica di legame di proteina diversi con i loro recettori selettivi. C'è flessibilità nella scelta fluorofori che forniranno cambiamenti nei valori J seconda dell.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Il sostegno finanziario per questo lavoro è stato fornito attraverso la National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), Materials Technology Center (MTC) e ORDA a SIUC. Ringraziamo NSF per una borsa di studio (CHE-0959568) per l'acquisto di un FE-SEM. Vorremmo ringraziare il Prof. Matteo McCarroll per le discussioni utili. Julia Reyes si ringraziare Colciencias, Agenzia colombiano e Universidad Pedagogica y Tecnologica de Colombia per la sua borsa di studio e sostegno finanziario.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| 10,12-pentacosadiynoic acido (PCDA) | GFS sostanze chimiche | 3261 | Sensibile alla luce |
| N-idrossisuccinimmide (NHS) | Acros organici | 157270250 | Umidità sensibile |
| 1 - (3 - (dimetilammino) propil)-3-etilcarbodiimmide cloridrato (EDC) | Chem-Impex International | 00050 | |
| 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | |
| Rodamina-tagged Ser Bovinium Albumina (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-phosphoethanolamine-N-(Biotinyl) (biotina-DOPE) | Avanti Polar Lipids | 870282 |
Riferimenti
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. (1999).
- Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly. Science. 261, 585-....
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Ristampe e permessi
