Dimostriamo la tecnica di base per progettare molecolare ed evolvere sintetici virale adeno-associati (AAV) vettori di terapia genica attraverso la famiglia shuffling DNA. Inoltre, fornire linee guida generali ed esempi rappresentativi per la selezione e l'analisi delle singole capsidi chimerici con proprietà migliorate sulle cellule bersaglio in coltura o nei topi.
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Articolo metodologico
Ingegneria ed evoluzione del sintetico virus adeno-associato (AAV) Vettori Terapia genica attraverso la famiglia Shuffling DNA
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Virali adeno-associati (AAV) vettori rappresentano alcuni dei veicoli più potenti e promettenti per il trasferimento del gene terapeutico umano a causa di una combinazione unica di proprietà benefiche 1. Questi includono la apathogenicity dei virus di tipo selvatico sottostanti e le metodologie più avanzate per la produzione di alta titolo di elevata purezza e vettori ricombinanti clinico-grado 2. Un ulteriore vantaggio particolare del sistema di AAV su altri virus è la disponibilità di una ricchezza di natura sierotipi che differiscono nelle proprietà essenziali ancora possono essere facilmente costruiti come vettori usando un protocollo comune 1,2. Inoltre, una serie di gruppi tra cui il nostro ha recentemente messo a punto le strategie per utilizzare questi virus naturali come modelli per la creazione di vettori sintetici, che combinano sia i beni di sierotipi di input, o che esaltano le proprietà di un singolo isolato. Le rispettive tecnologie per raggiungere questi obiettivi are sia DNA shuffling famiglia 3, ossia la frammentazione di vari geni del capside di AAV seguita dalla loro rimontaggio basato su omologie parziali (tipicamente> 80% per la maggior parte sierotipi di AAV), o visualizzare peptide 4,5, inserimento cioè di solito in sette aminoacidi un ciclo esposta del capside virale in cui il peptide idealmente media ri-targeting per un tipo cellulare desiderato. Per il massimo successo, entrambi i metodi sono applicati in un high-throughput di moda in cui i protocolli sono up-scalati per produrre librerie di circa un milione di varianti distinte del capside. Ciascun clone è quindi composto da una combinazione unica di numerosi virus parentale (DNA shuffling approccio) o contiene un peptide distintivo all'interno della stessa dorsale virale (approccio visualizzazione peptide). Il successivo passo finale è iterativa selezione di tale libreria sulle cellule bersaglio, al fine di arricchire per capsidi individuali che soddisfano la maggior parte o idealmente tutti i requisiti del processo di selezione. Quest'ultimo preferibilmente pettineines pressione positiva, come la crescita su un tipo di cellula certo interesse, con la selezione negativa, per esempio, l'eliminazione di tutti i capsidi che reagiscono con gli anticorpi anti-AAV. Questa combinazione aumenta la probabilità che capsidi sintetici sopravvissuti alla selezione corrispondono alle esigenze del data applicazione in un modo che probabilmente non sono stati trovati in ogni naturale AAV isolare. Qui, ci concentriamo sul metodo famiglia DNA shuffling come teoricamente e sperimentalmente più impegnativo delle due tecnologie. Descriviamo e dimostrare tutti i passi essenziali per la generazione e la selezione di librerie mischiate AAV (Fig. 1), e poi discutere le insidie e gli aspetti critici dei protocolli che bisogna essere a conoscenza al fine di avere successo con l'evoluzione molecolare AAV.
Protocollo
1. Preparazione del set di plasmide che codifica AAV geni del capside
- Per facilitare la preparazione di routine di quantità sufficienti delle varie capside di AAV (tappo) geni di DNA shuffling successiva, inizialmente subclonare questi geni in una dorsale comune plasmide. È importante comprendere identiche sequenze fiancheggianti di> 20 nucleotidi per un uso successivo come siti di legame del primer nested PCR e per la clonazione (Fig. 2).
- Utilizzando primers appropriati (vedi tabella per i primer esemplari per AAV5), PCR amplificare i geni desiderati dal cap comunemente disponibili plasmidi AAV che di solito co....
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Discussione
Qui, abbiamo delineato i passaggi essenziali e le linee guida sperimentali per la AAV capside engineering attraverso la famiglia rimescolamento del DNA e per l'evoluzione in cellule o negli animali. In sostanza, questi protocolli sono versioni standard delle procedure che per primi hanno riportato all'interno del campo AAV nel 2008 3. Mentre una raffica di follow-up da altri studi hanno riportato numerose modifiche ad esempio, 10-13, i siti attuali rappresentano strategie fondament.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori dichiarano di non avere nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il supporto eccezionale di loro laboratorio, i membri del team e il lavoro del cluster di eccellenza CellNetworks all'Università di Heidelberg così come dalla Chica e Heinz Schaller (CHS) fondazione. Apprezziamo che l'evoluzione molecolare AAV via DNA shuffling famiglia è diventata un campo molto attivo dato che la nostra prima pubblicazione, tre anni fa e quindi chiedere scusa a tutti gli autori di pubblicazioni rilevanti il cui lavoro non potevano essere citati qui a causa di vincoli di spazio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | |
| DNasi I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Polietilenimmina (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Gli enzimi di restrizione | NEB | Vario | |
| DNA ligasi T4 | NEB | M0202T | |
| Gel kit di estrazione | Qiagen | 28704 | |
| Phusion polimerasi II Kit | Finnzymes (NEB) | F-540S | |
| HotStar Hifi polimerasi Kit | Qiagen | 202602 | |
| DMSO | Finnzymes (NEB) | F-540S (parte del kit) | |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (parte del kit) | |
| Tris | Roth | 4.855,2 | |
| Ampicilin sale di sodio | Roth | K029.2 | |
| dNTP (10 mM, 100 pl) | Invitrogen | 18427013 | |
| Iodixanolo (OptiPrep) | Axis-Shield | 1114739 | |
| Phenolred | Merck | 107241 | |
| Plasmide kit di preparazione mega | Qiagen | 12181 | |
| Ultracentrifuga | Beckman-Coulter | Optima L90K | |
| Quick-Seal provette da centrifuga; | Beckman-Coulter | 342414 | |
| Elettroporazione unità | Bio-Rad | GenePulserXcell | |
| Termociclatore | Eppendorf | Vapo Protect | |
| Riscaldamento blocco | BIOER | MB-102 | |
| Microscopio a fluorescenza | Olimpo | IX81 | |
| FACS analizzatore | Beckman-Coulter | Cytomics FC500 MLP | |
| MegaX DH10B T1R cellule | Invitrogen | C640003 | |
| Benzonase | Merck | 101695 | |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 | |
| pBlueScript II KS (+) plasmide | Stratagene | 212207 | |
| cap5F (Pac sito che ho in giallo, CAP5 specifiche sequenze in grassetto): GACTCTTAATTAACAGGT ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC | IDTDNA | Primer personalizzato | |
| cap5R (Asc sito che ho in verde, CAP5 specifiche sequenze in grassetto): GTGAGGGCGCGCC TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC | IDTDNA | Primer personalizzato |
Riferimenti
- Grimm, D., Kay, M. A. From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).
- Grimm, D.
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Ristampe e permessi
