Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging

Summary

In questo articolo descriviamo un metodo che utilizza multi-spettrale di citometria a flusso di imaging per quantificare l'interiorizzazione delle nanoparticelle polianidride o batteri da parte delle cellule RAW 264.7.

Abstract

Sistemi di nanoparticelle sono emersi come strumenti preziosi nella consegna vaccino attraverso la loro capacità di fornire in modo efficiente merci, ivi compresi le proteine, le cellule presentanti l'antigene ^1-5. Internalizzazione di nanoparticelle (NP) da cellule presentanti l'antigene è un punto critico nel generare una risposta immunitaria all'antigene incapsulato. Per determinare come le alterazioni della funzionalità impatto formulazione di nanoparticelle, abbiamo cercato di sviluppare un elevato throughput, il protocollo sperimentale quantitativa che fosse compatibile con rilevare le nanoparticelle internalizzate così come batteri. Ad oggi, due tecniche indipendenti, microscopia e citometria di flusso, sono stati i metodi utilizzati per studiare la fagocitosi di nanoparticelle. La natura throughput elevato della citometria a flusso genera solidi dati statistici. Tuttavia, a causa della bassa risoluzione, non riesce a quantificare con precisione internalizzati contro cellule nanoparticelle associati. Microscopia genera immagini ad alta risoluzione spaziale; hazione sul mercato, è in termini di tempo e coinvolge campioni di piccole dimensioni ^6-8. Multi-spettrale citometria a flusso di immagini (MIFC) è una nuova tecnologia che incorpora aspetti di microscopia e di citometria a flusso che esegue multi-color immagini spettrali di campo fluorescenza e luminoso simultaneamente attraverso un nucleo laminare. Questa funzionalità fornisce un'analisi accurata di intensità di segnale fluorescenti e le relazioni spaziali tra le diverse strutture e funzioni cellulari ad alta velocità.

Qui, descriviamo un metodo che utilizza MIFC per caratterizzare le popolazioni di cellule che hanno interiorizzato nanoparticelle polianidride o Salmonella enterica sierotipo Typhimurium. Si descrivono anche la preparazione di sospensioni di nanoparticelle, etichettatura cellulare, su un sistema di acquisizione ImageStream ^X e l'analisi dei dati utilizzando l'applicazione IDEE. Abbiamo inoltre dimostrato l'applicazione di una tecnica che può essere utilizzata per differenziare il p internalizzazioneathways per nanoparticelle e batteri utilizzando citocalasina-D come un inibitore di actina-mediata fagocitosi.

Protocol

1. RAW 264,7 Colture Cellulari

1. Harvest RAW 264.7 cellule dai loro fiaschi quando raggiungano la confluenza raschiando delicatamente con una spatola delle cellule. Conte e la piastra in un 24-ben piatto di coltura delle cellule ad una densità di 5 x 10 ⁵ cellule / pozzetto in 0,5 mL completa Medio Dulbeccòs Modified Eagle (cDMEM; 10% inattivato al calore siero fetale bovino (FBS), 2 mM Glutamax, e HEPES 10 mM) e incubare durante la notte a 37 ° C in 5% CO ₂ incubatore.

2. Patogeno Salmonella enterica sierotipo Typhimurium 14.028 Trasformazione e Cultura

1. Introdurre plasmidi ricombin....

Discussion

Studi hanno dimostrato che le nanoparticelle biodegradabili a base di poli (lattico-co-glicolico (PLGA) o polianidridi possono essere usati per fornire antigeni incapsulati o farmaci alle cellule bersaglio. Assorbimento di tali nanoparticelle di cellule fagocitiche è importante per la loro efficacia, rendendo quantitativa . analisi di interiorizzazione critica nella progettazione di nuovi sistemi di consegna delle nanoparticelle Utilizzando questo metodo, assorbimento differenziale di nanoparticelle di vari tipi di cell.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
RAW 264,7 linea cellulare	Type Culture Collection (ATCC)	TIB-71
Dulbeccòs Modified Eaglès Medium (DMEM)	Cellgro	10-013-CV
Siero fetale bovino	Atlanta Biologicals	S 11150	Premium Grade
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
Piastra da 24 pozzetti	TPP	92024
Coltura cellulare Boccette	TPP	90151
Cella scraper	TPP	99002	24 cm
Salmonella enterica sierotipo Typhimurium	ATCC	14028
BTX ECM630 Manipolatore cella Electro	BTX Harvard Apparatus
MOPS	Fisher Scientific	BP308
Soluzione salina tamponata (PBS)	Cellgro	21-040-CV
Ultrasuoni processore liquido	Misonix	S-4000
Citocalasina D-	Sigma-Aldrich,	C8273
Formaldeide	Polysciences	04018
Tampone di lavaggio	2% di FBS inattivato, sodio azide allo 0,1% in PBS.
Perm / tampone di lavaggio	BD Biosciences	554714
Clear-visualizzare microprovette tappo a scatto	Sigma	T4816
Alexa Fluor 660 phalloidin	Invitrogen	A22285
ImageStream X	Amnis Corporazione	100200	Opzioni: 658nm laser, autocampionatore
Sodio azide	Fisher Scientific	S 227I-500