Qui si descrive un metodo rapido e semplice per misurare la rigidità delle cellule. Il principio generale di questo approccio è di misurare la deformazione della membrana in risposta a ben definito pressione negativa applicata mediante una micropipetta alla superficie cellulare. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare le proprietà biomeccaniche del substrato-attached cellule.
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Articolo metodologico
Aspirazione Micropipetta di celle substrato-attached per Stima rigidità cellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Crescente numero di studi dimostrano che le proprietà biomeccaniche delle singole cellule svolgono un ruolo importante in molteplici funzioni cellulari, tra cui la proliferazione cellulare, la differenziazione, la migrazione e interazioni cellula-cellula. I due parametri chiave di biomeccanica cellulari sono deformabilità cellulare o rigidità e la capacità delle cellule di contrarsi e generare forza. Qui si descrive un metodo rapido e semplice per valutare la rigidità cellulare misurando il grado di deformazione della membrana in risposta alla pressione negativa applicata da una micropipetta di vetro alla superficie cellulare, una tecnica che si chiama Aspirazione Micropipetta o microaspirazione.
Microaspirazione viene eseguita tirando un capillare di vetro per creare una micropipetta con una punta molto piccola (2-50 micron di diametro a seconda delle dimensioni di una cellula o di un campione di tessuto), che viene poi collegato ad un trasduttore di pressione pneumatica e portato a termine prossimità di una cellula al microscopio. Quando l'punta della pipetta tocca una cella, una fase di pressione negativa è applicata alla pipetta dal trasduttore di pressione pneumatica di generazione di pressione ben definito sulla membrana cellulare. In risposta alla pressione, la membrana viene aspirata nella deformazione della membrana pipetta e progressivo o "proiezione membrana" nella pipetta viene misurato in funzione del tempo. Il principio di base di questo approccio sperimentale è che il grado di deformazione della membrana in risposta ad una forza meccanica definita è una funzione della rigidezza della membrana. La membrana è più rigido, più lenta è la velocità di deformazione della membrana e più breve è il regime tecnica length.The aspirazione può essere eseguita su cellule isolate, sia in sospensione e substrato-annessi, organelli grandi, e liposomi.
Analisi viene eseguita confrontando deformazioni della membrana massimi raggiunti sotto una data pressione di diverse popolazioni cellulari o condizioni sperimentali. Un "coefficiente di rigidezza" è estimated tracciando la lunghezza aspirato di deformazione della membrana in funzione della pressione applicata. Inoltre, i dati possono essere ulteriormente analizzati per stimare il modulo di Young delle cellule (E), il parametro più comune per caratterizzare rigidità dei materiali. È importante notare che la membrana plasmatica delle cellule eucariotiche possono essere visti come una bi-componente in cui è underlied bistrato lipidico di membrana dalla sub-membrana citoscheletro e che è il citoscheletro che costituisce l'impalcatura meccanica della membrana e domina la deformabilità della busta cellulare. Questo approccio, pertanto, permette di sondare le proprietà biomeccaniche del sub-membrana citoscheletro.
Protocollo
1. Tirare Micropipette di vetro
Attrezzatura: Micropipetta Puller, microforgia.
Vetro: Boroscillicate capillari di vetro (~ diametro 1,5 mm esterno, ~ 1.4 mm di diametro interno).
- Micropipette sono tirati utilizzando lo stesso approccio di base che viene usato per preparare microelettrodi di vetro per registrazioni elettrofisiologiche. Brevemente, un capillare di vetro viene riscaldata nel mezzo e quando il vetro inizia a fondere le due metà del capillare sono staccati generando due micropipette. Più estrattori commerciali sono a disposizione per es....
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Discussione
Microaspirazione fornisce un metodo semplice e altamente riproducibili stimare rigidità cellule / deformabilità applicando pressione negativa ad una membrana cellulare e misurare la deformabilità della membrana in risposta alla pressione ben definita. È stato inizialmente sviluppato da Mitchison e Swann (1954) per caratterizzare le proprietà elastiche dei ricci di mare uova di fornire uno sguardo sui meccanismi di divisione cellulare 21 e poi a guardare le proprietà meccaniche dei globuli rossi 1. .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Catalogo / Numero del modello | Commenti |
| Sutter pipetta estrattore | Sutter Instruments | P-97 | |
| Microforgia | Narishige | MF-830 | |
| Invertito microscopio a fluorescenza | Zeiss | Axiovert 200M | Il microscopio deve essere preferibilmente dotata di capacità 3D/deconvolution. |
| Videocamera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Acquisizione di immagini sotware | Zeiss | AxioVision | |
| Trasduttore di pressione pneumatica | BioTek | DPM-1B | DPM1B Tester trasduttore pneumatico può essere trovato da FLUKE. |
| Pipetta di vetro | Richland | Vetro su misura | Pipette sono stati personalizzati con un diametro interno 1,2 e 1,6 diametro esterno. |
| DiI Dye | Invitrogen | D282 | Si scioglie bene in DMSO |
Riferimenti
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical properties of the red cell membrane. I. Membrane stiffness and intracellular pressure. Biophys. J. 4, 115-135 (1964).
- Discher, D. E., Mohandas, N., Evans, E. A. Molecular maps of red cell deformation: hidde....
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Ristampe e permessi
