A Step-by-step Metodo per la ricostituzione di un Transporter ABC in particelle lipidiche Nanodisc

Sommario

Nanodiscs sono piccole particelle discoidali che incorporano proteine ​​di membrana in una piccola zona di doppio strato di fosfolipidi. Forniamo un protocollo visivo che mostra il passo-passo incorporazione del trasportatore MalFGK2 in un disco.

Abstract

Il nanodisc è una particella discoidale (~ 10-12 nm di grandi dimensioni) che le proteine ​​di membrana trappola in una piccola zona di doppio strato di fosfolipidi. Il nanodisc è un'opzione particolarmente interessante per studiare proteine ​​di membrana, in particolare nel contesto delle interazioni ligando-recettore. Il metodo introdotto da Sligar e colleghi si basa sulle proprietà di un anfipatiche altamente ingegnerizzato ad a-elica proteina scaffold derivato dal apolipoproteina A1. Le facce idrofobe della proteina scaffold interagire con i grassi acil catene laterali del doppio strato lipidico che le regioni polari affrontare l'ambiente acquoso. Analisi di proteine ​​di membrana in nanodiscs hanno vantaggi significativi rispetto liposoma perché le particelle sono piccole, omogenea e idrosolubile. Inoltre, metodi biochimici e biofisici normalmente riservati alle proteine ​​solubili possono essere applicati, e da entrambi i lati della membrana. In questo protocollo visiva, presentiamo un passo-passo ricostituzione di un carattere benterizzato trasportatore batterica ABC, il maschio-MalFGK ₂ complessi. La formazione del disco è un processo di auto-assemblaggio che dipende da interazioni idrofobiche che avvengono durante la rimozione progressiva del detersivo. Si descrivono le fasi essenziali e sottolineano l'importanza di una corretta scelta proteina-lipide rapporto al fine di limitare la formazione di aggregati e grandi polidispersi liposoma-come particelle. Qualità semplici controlli, come la cromatografia di gel filtrazione, elettroforesi su gel nativo e dinamico spettroscopia di dispersione della luce in modo che i dischi sono stati adeguatamente ricostituito.

Protocollo

Ricostituzione del processo globale

Il processo inizia ricostituzione miscelando la membrana proteina scaffold (MSP) con il complesso purificato MalFGK ₂ in presenza di detergente-solubilizzate fosfolipidi. La fase è seguita dalla rimozione lenta del detergente da un materiale adsorbente polistirene chiamato Bio-Beads o Amberlite (Figura 1). L'auto-assemblaggio processo si verifica molto probabilmente a causa delle interazioni tra i fosfolipidi apolari idrofobici, la MalFGK ₂ complessi e la superficie della proteina MSP anfipatica. Il prodotto finale è una particella discoide fatta di due molecole di MS....

Discussione

Descriviamo una semplice procedura per la ricostituzione del trasportatore maltosio in nanodiscs. Il trasportatore è ATPasi attiva e l'interazione con il maschio solubile partner di legame può essere ricreato (Figura 3). La ricostituzione di successo del trasportatore in nanodiscs aprire la strada a ulteriori analisi biofisica e biochimica. Di particolare interesse sarà l'analisi sistematica della ATPasi MalK e attività di trasporto in maltosio detersivo, liposomi e nanodiscs. Trasportatori ABC .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Amicon Ultra-4 50K filtro centrifugo	Millipore	UFC805008	Segui protocollo del produttore per un uso corretto
Bio-Beads SM-2 Adsorbente	Bio-Rad	152-3920
E. coli lipidi totali	Avanti Polar Lipids	100500C	Disciolto in cloroformio, come appropriato per gestire un solvente organico
Ni sefarosio HP resina	GE Healthcare	17-5268-01
Fosforo soluzione standard	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Tabella I. reagenti specifici.
			Nome Composizione Commenti DDM magazzino 10% w / v DDM Risospendere in acqua MilliQ e conservare a -20 ° C MalFGK 2 stock 1-2 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v glicerolo 0,03% w / v DDM Conservare a -70 ° C dopo purificazione MSP magazzino 10-15 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v glicerolo Conservare a -70 ° C dopo la purificazione nel Fosfolipidi magazzino 5 nM E. coli totale lipidi 0,5% w / v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl Conservare a 4 ° C per 1 settimana TS tampone 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl Conservare a 4 ° C TSG10 tampone 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v glicerolo Conservare a 4 ° C TSG20 tampone 50 mM Tris-HCl, pH 8 100 mM NaCl 20% v / v glicerolo Conservare a 4 ° C TSGD tampone 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v glicerolo 0,03% w / v DDM Conservare a 4 ° C e aggiungere DDM poco prima dell'uso Tabella II. Soluzione ricette.