Noi descriviamo una metodologia rapida per isolare e cultura neuroni dell'ippocampo e corticale da embrioni di roditori. Questo protocollo permette di effettuare esperimenti in cui sono richieste colture neuronali quasi puri.
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Articolo metodologico
Isolamento e la coltura di cellule embrionali neuronali di ratto: un protocollo veloce
In questo articolo
Sommario
Abstract
Stiamo descrivendo un metodo rapido di dissociarsi e di cultura neuroni dell'ippocampo o corticale da E15-17 embrioni di ratto. La procedura può essere applicata con successo per l'isolamento del mouse e neuroni umani primari e progenitori neurali. Neuroni dissociati sono mantenuti in terreno privo di siero fino a diverse settimane. Queste colture possono essere utilizzati per nucleofection, immunocitochimica, acidi nucleici preparazione, nonché elettrofisiologia. Vecchi colture neuronali possono anche essere trasfettate con un tasso di buona efficienza di trasduzione lentivirale e, meno efficiente, con fosfato di calcio o base di lipidi metodi come lipofectamina.
Protocollo
1. Poly-D-lisina (PDL): Preparazione
- Aggiungere 5 ml di soluzione sterile ddh 2 O a 5 mg di PDL per ottenere una soluzione stock di 1 mg / ml.
- Mescolare soluzione madre pipettando più volte.
- Utilizzare immediatamente o memorizzare Poly-D-lisina soluzione a 2-8 ° C.
2. Poly-D-lisina (PDL): rivestimento in plastica Piatti di coltura cellulare
- Diluire la soluzione stock con PDL sterile ddh 2 O alla concentrazione finale di 10 mcg / ml.
- Pipettare soluzione sufficiente in piastre da 60 mm a coprire superficie cultura (3 ml per piastre da 60 mm).
- Oscillare....
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Discussione
Il metodo di dissezione e cultura di neuroni ippocampali di ratto e corticale qui descritto permette di eseguire esperimenti utilizzando colture neuronali quasi purezza coltivate in un mezzo chimicamente definito (Figura 3). Anche se i protocolli per i neuroni coltura quasi pura nel siero senza supporti sono stati precedentemente descritti 2,3,4, ci sono importanti cambiamenti nel nostro metodo. Diverso da protocolli tradizionali (vale a dire Banker et al.) 5, abbiamo sostituito tr.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo Jonna Ellis per l'assistenza editoriale. Il progetto descritto è stato sostenuto da Number Award R01MH079751 (PI: F. Peruzzi), dal National Institute of Mental Health. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali dell'Istituto Nazionale di Salute Mentale o il National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente | Concentrazione | ||
| Neurobasal | 98% | ||
| B27 | 2% | ||
| Glutamax | 0,5 mM |
Tabella I. Neurobasal/B27 mezzo completo.
| Reagente | Concentrazione |
|---|---|
| Glucosio | 16 mM |
| Saccarosio | 22 mm |
| HEPES | 10 mM |
| NaCl | 160 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na 2 HPO 4 | 1 mM |
| KH 2 PO 2 | 0,22 mm |
| Gentamicina | 50 ug / ml |
| Fungizone | 250 ng / ml |
| pH | 7,4 |
| Osmolarità | 320-330 mOsm |
Tabella II. Dissezione mezzo.
| Reagente | Volume (pl) |
|---|---|
| Neurobasal/B27 terreno completo | 240 |
| Trypan Blue Stain 0,4% | 250 |
| Totale | 490 |
Tabella III. 50x conteggio soluzione.
| Reagente | Azienda | Cat. numero |
|---|---|---|
| E Hibernate | Brainbits | 767171 |
| Neurobasal | Gibco, Invitrogen | 21103-049 |
| B27 | Gibco, Invitrogen | 17504-044 |
| Fungizone | Gibco, Invitrogen | 15290-018 |
| Gentamicina solfato | Sigma Aldrich | G1264 |
| Glutamax 200 mM | Gibco, Invitrogen | 35050 |
| Triplo espresso w / o rosso fenolo | Gibco, Invitrogen | 12604 |
| Citosina-β-D-arabinofuranoside cloridrato | Sigma Aldrich | C6645 |
| Poly-D-lisina | Sigma Aldrich | P6407 |
| Laminina 1 mg / ml | Millipore | CC095 |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 |
| Trypan Blue Stain 0,4% | Gibco, Invitrogen | 15250 |
Tabella IV. Reagenti specifici.
| Attrezzatura | Azienda | Cat. numero |
|---|---|---|
| Microscopio Stereo | Olimpo | SZ61 |
| Pinze di grandi dimensioni | FST | 11022-14 |
| Punta fine pinze | Moria | MC40B |
| Micro punta fine pinze | Moria | MC31 |
| Affilate le forbici | Roboz | RS-6820 |
| Micro forbici per dissezione | FST | 91460-11 |
| Micro dissezione forbici curve | FST | 14067-11 |
| Vetro 2-camera vetrini | Lab-Tek | 154461 |
| 60 piatti mm | BD Falcon | 353002 |
| Dischi da 100 mm | Corning | 430167 |
| 15 ml provette | BD Falcon | 352099 |
| 1,5 ml crio-tube vial | Nunc | 375353 |
Attrezzature Tabella V. specifico.
Riferimenti
- Aprea, S. Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage. J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H.
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Ristampe e permessi
