High-throughput mappatura fisica dei cromosomi con modalità automatizzate In situ Ibridazione

Sommario

Gli assemblaggi del genoma basati su tecnologie di sequenziamento del DNA massivamente parallele sono solitamente altamente frammentati. Lo sviluppo di mappe cromosomiche fisiche può potenzialmente migliorare gli assemblaggi del genoma. Qui, dimostriamo approcci innovativi alla preparazione dei cromosomi, all'ibridazione fluorescente in situ e all'imaging che aumentano significativamente la produttività dello sviluppo della mappa fisica.

Abstract

Si prevede che nei prossimi 5 anni si realizzeranno progetti per ottenere sequenze dell'intero genoma per 10.000 specie di vertebrati¹ e per 5.000^{specie di} insetti e artropodi correlati. Ad esempio, il sequenziamento dei genomi di 15 specie di zanzare malariche è attualmente in corso utilizzando una piattaforma Illumina^3,4. Questo cluster di specie di Anopheles include sia vettori che non vettori di malaria. Quando gli assemblaggi del genoma saranno disponibili, i ricercatori avranno l'opportunità unica di eseguire analisi comparative per dedurre i cambiamenti evolutivi rilevanti per la capacità del vettore. Tuttavia, si è dimostrato difficile utilizzare le letture di sequenziamento di nuova generazione per generare assemblaggi genomici de novo di alta qualità⁵. Inoltre, gli assemblaggi genomici esistenti per Anopheles gambiae, sebbene ottenuti utilizzando il metodo Sanger, sono separati o frammentati^4,6.

Il successo delle analisi genomiche comparative sarà limitato se i ricercatori si occuperanno di numerosi contigs di sequenziamento, piuttosto che di assemblaggi genomici basati sui cromosomi. Le sequenze frammentate e non mappate creano problemi per le analisi genomiche perché: (i) lacune non identificate causano un'annotazione errata o incompleta delle sequenze genomiche; (ii) le sequenze non mappate portano a confusione tra geni paraloghi e geni di diversi aplotipi; e (iii) la mancanza di assegnazione cromosomica e di orientamento dei contig di sequenziamento non consente di ricostruire, riarrangiare, filogenesi e studiare l'evoluzione cromosomica. Lo sviluppo di mappe fisiche ad alta risoluzione per le specie con genomi appena sequenziati è un investimento tempestivo ed economico che faciliterà l'annotazione del genoma, l'analisi evolutiva e il risequenziamento di singoli genomi da popolazioni naturali^7,8.

Qui, presentiamo approcci innovativi alla preparazione dei cromosomi, all'ibridazione fluorescente in situ (FISH) e all'imaging che facilitano il rapido sviluppo di mappe fisiche. Usando An. gambiae come esempio, dimostriamo che lo sviluppo di mappe cromosomiche fisiche può potenzialmente migliorare gli assemblaggi del genoma e, quindi, la qualità delle analisi genomiche. Innanzitutto, utilizziamo un metodo ad alta pressione per preparare le diffusioni cromosomiche del politene. Questo metodo, originariamente sviluppato per Drosophila⁹, consente all'utente di visualizzare più dettagli sui cromosomi rispetto alla normale tecnica di schiacciamento¹⁰. In secondo luogo, per la mappatura fisica del genoma ad alto rendimento viene utilizzato un sistema front-end completamente automatizzato per la FISH. Il sistema automatizzato di colorazione dei vetrini esegue più saggi contemporaneamente e riduce drasticamente il tempo di intervento¹¹. In terzo luogo, un sistema di imaging fluorescente automatico, che include un tavolino di scorrimento motorizzato, scansiona e fotografa automaticamente i cromosomi marcati dopo FISH¹². Questo sistema è particolarmente utile per identificare e visualizzare più piastre cromosomiche sullo stesso vetrino. Inoltre, il processo di scansione acquisisce un risultato FISH più uniforme. Nel complesso, il protocollo di mappatura fisica automatizzato ad alta velocità è più efficiente di un protocollo manuale standard.

Protocollo

1. Preparazione del cromosoma politene ad alta pressione da cellule nutrici ovariche

1. Sezionare le femmine semigravide di Anopheles a 25 ore dall'alimentazione del sangue al microscopio da dissezione e fissare le ovaie in una soluzione di Carnoy fresca modificata con metanolo (metanolo al 100%: acido acetico glaciale, 3:1). In questa fase le ovaie sono allo stadio di sviluppo III di Christophers, quando i follicoli hanno una forma ovale e un'area trasparente con cellule nutrici all'interno dei follicoli ha una forma rotonda¹³. Mettere le ovaie di circa cinque femmine in 500 μl di soluzione di Carnoy modificata in una provetta Eppendorf da 1,5 ml e tenerle a temperatura ambiente per 24 ore. Trasferire le ovaie a -20 °C per una conservazione a lungo termine.
2. Preparare la soluzione di Carnoy modificata con etanolo (etanolo al 100%: acido acetico glaciale, 3:1) e acido propionico al 50% appena prima di creare i vetrini. Posizionare un paio di ovaie su un vetrino privo di polvere in una goccia di soluzione di Carnoy modificata. Dividere le ovaie in circa 6 sezioni con aghi da dissezione e metterle in gocce di acido propionico al 50% su vetrini puliti sotto uno stereomicroscopio Leica MZ6 di dissezione. Utilizzare una diapositiva separata per ogni sezione.
3. Separare i follicoli dissezionati con gli aghi e rimuovere il tessuto rimanente con carta da filtro o tovagliolo di carta al microscopio da dissezione. Aggiungi una nuova goccia di acido propionico al 50% ai follicoli e lasciali riposare per 3-5 minuti a temperatura ambiente. Posizionare un vetrino coprioggetti sopra la gocciolina di acido propionico al 50%. Lasciare riposare il vetrino per circa 1 minuto.
4. Avvolgere il vetrino con carta da filtro e plastica. Utilizzando un utensile rotante Dremel 200 con attacco Flex-Shaft e punta in plastica morbida impostata tra 3000 e 5000 giri/min, esprimi i follicoli facendo roteare la punta in cerchi e premendo leggermente il vetrino coprioggetti per distribuire uniformemente i nuclei. Questo passaggio dovrebbe richiedere circa 1 minuto. Controlla la qualità della diffusione con un microscopio di fase Olympus CX41 utilizzando un obiettivo 20x.
5. Preparare un panino posizionando un vetrino coprioggetti aggiuntivo accanto al vetrino coprioggetti che copre i cromosomi e coprirli con un secondo vetrino da microscopio. Ciò riduce la possibilità di schiacciare la slitta nella morsa. Avvolgere i vetrini con un foglio di plastica che viene fornito in contenitori di vetro per vetrini e carta da filtro per tenere il panino e per proteggere il vetrino dai graffi dovuti alla morsa.
6. Applicare pressione alle slitte tramite morsa meccanica. Una pressione di 85-120 pollici-libbre è sufficiente e si ottiene utilizzando una chiave dinamometrica. Questo passaggio è necessario per appiattire il più possibile i cromosomi.
7. Rimuovere il secondo vetrino da microscopio e il vetrino coprioggetti aggiuntivo. Riscaldare il vetrino con il vetrino coprioggetti che copre i cromosomi a 55 °C su un sistema di denaturazione/ibridazione del vetrino per 10-15 minuti per appiattire ulteriormente i cromosomi. Immergere il vetrino in azoto liquido per almeno 15 secondi e, quando il gorgogliamento si è fermato, procedere alla rimozione rapida del vetrino coprioggetti con una lametta. Posizionare immediatamente i vetrini in etanolo freddo al 50% per 5 minuti. Disidratare i vetrini in etanolo al 70%, 90%, 100% per 5 minuti ciascuno. Scivoli asciutti all'aria.

2. FISH utilizzando un sistema automatizzato di colorazione dei vetrini

Il programma è impostato con il sistema automatizzato di colorazione dei vetrini Xmatrx per eseguire i seguenti passaggi, ad eccezione dell'etichettatura della sonda. Il protocollo dettagliato di marcatura della traduzione è descritto nella documentazione fornita con la DNA polimerasi di Fermentas.

1. Prima della FISH, preparare le sonde fluorescenti marcando il DNA genomico BAC con un fluorocromo utilizzando un protocollo di traduzione nick. Miscelare 1 μg di DNA, 0,05 mM ciascuno di dATP, dCTP e dGTP non marcati e 0,015 mM di dTTP, 1 μl di Cy3- o Cy5-dUTP, 0,05 mg/ml di BSA, 5 μl di tampone di traduzione nick 10x, 20 unità di DNA polimerasi I, 0,0012 unità di DNasi I e acqua priva di nucleasi fino a 25 μl. Il rapporto DNA polimerasi I/DNasi I è selezionato empiricamente per ottenere sonde con un intervallo di dimensioni da 300 a 500 bp. Incubare la miscela a 15 °C per 1 ora.
2. Inserire i vetrini e i reagenti nel sistema di colorazione automatizzata dei vetrini Xmatrx e avviare il programma per eseguire i passaggi successivi. Applicare 800 μl di 1x PBS per 20 min. Soffiare gli scivoli con l'aria. Eseguire la fissazione della formalina applicando 450 μl di formalina al 4% in 1x PBS per 1 minuto, seguiti da lavaggi con etanolo al 100% per 1 secondo due volte e per 2 minuti una volta. Soffiare gli scivoli con l'aria.
3. Il calore scorre a 45 °C per 2 minuti per evitare bolle durante l'applicazione delle sonde. Applicare 20 μl di sonde di DNA, aggiungere gocce di olio minerale per evitare l'evaporazione di una soluzione di ibridazione e posizionare sopra un vetrino coprioggetti. Denaturare i cromosomi e le sonde di DNA riscaldando i vetrini a 90 °C per 10 minuti.
4. Per l'ibridazione, incubare i vetrini a 42 °C per 14 ore con i vetrini. La soluzione di ibridazione è composta da 2 SSC, 100 mM di fosfato di sodio, 1 soluzione di Denhardt, 100 μg/ml di azoturo di sodio e il 10% di destrano solfato in formammide.
5. Per lavaggi rigorosi, riscaldare i vetrini a 42 °C per 2 minuti, rimuovere i vetrini, lavare i vetrini in 2x SSC per 1 secondo 4 volte. Soffiare gli scivoli con l'aria. Applicare 800 μl di SSC 0,4x a 42 °C per 10 minuti 2 volte. Lavare i vetrini in 2x SSC a 25 °C per 10 min.
6. Eseguire la colorazione cromosomica applicando 50 μl di 1 μM YOYO-1 in 1x PBS. Applicare gocce di olio minerale per evitare l'evaporazione della soluzione colorante, applicare i vetrini coprioggetti e incubare a 25 °C per 10 minuti. Rimuovere i vetrini, lavare i vetrini in 2x SSC per 1 sec 4 volte. Soffiare gli scivoli con l'aria. Applicare 15 μl di reagente antisbiadimento ProLong Gold. Indossa i vetrini.

3. Lettura dei vetrini con un sistema di imaging fluorescente automatico

Questa sezione descrive in dettaglio l'uso del software Duet, che viene fornito di serie con il sistema di scansione automatizzato ACCORD PLUS. Le istruzioni iniziano dopo l'accensione in questo ordine: alimentatore Olympus U-RFL-T per una lampadina alogena, computer Dell precision T3500, microscopio Olympus BX61 con una fotocamera collegata Olympus U-CMAD3.

1. Per impostare la pre-scansione 10x, aprire il software Duet nel sistema di scansione automatizzata ACCORD PLUS. Fare clic sul pulsante "Online". Inserisci il nuovo ID caso e assegna un ID diapositiva. Fai clic sul punto con l'etichetta "BF". Questa è l'opzione del campo chiaro. Impostare un'opzione di scansione su "Prescansione 10x". Usa "2500x cerchio", "10000x cerchio" o "rettangolo". Fare clic su "Imposta ed esegui" per la pre-scansione 10x.
2. Fare clic sul pulsante "OK" per eseguire la pre-scansione 10x. Seguire le istruzioni per regolare correttamente la scansione. Fare clic su "Fine" per avviare la scansione. Premi la scheda "Principale" per tornare alla schermata principale. Fai clic sul pulsante "Offline". Trova l'ID caso e l'ID diapositiva che ti sono stati assegnati e fai clic su "Scansione offline". Nella casella nera in alto a sinistra, fai clic su una freccia e seleziona "10x Prescan". Utilizzando le frecce (< || Δ > noti anche come pulsanti "indietro", "pausa", "play", "avanti"), scorrere le immagini acquisite.
3. Dopo aver trovato un'immagine di interesse, fai doppio clic sullo schermo al centro della regione di destinazione e premi "Snap". In questo modo verrà individuata un'immagine da acquisire in un secondo momento. Dopo aver selezionato tutti gli obiettivi, fai clic su "Classifica". Seleziona "10x Prescan". Fai clic con il pulsante destro del mouse su un'immagine e avrai la possibilità di classificare le immagini. Seleziona "Politene".
4. Impostare la pre-scansione 40x nel software Duet. Fai clic su "Principale" per tornare al menu principale. Seleziona di nuovo "Online". Seleziona una diapositiva. Cambia "BF" in "FL". Cambia il nome dell'attività in "Revisit-X40-RG". Cambia la sezione proprio sotto l'ultima impostazione in "Rivisita-TUTTO". Fai clic su "Imposta ed esegui". Premi "OK". Segui nuovamente le istruzioni per impostare l'automazione. Fai clic sul pulsante "Inizia ad abbinare le visualizzazioni" per abbinare le immagini 10x e 40x. Fare clic su "Fine" per avviare la scansione. Una volta terminato, fai clic su "Classifica" e guarda le immagini.

4. Risultati rappresentativi

La Figura 1 illustra graficamente lo schema della preparazione del cromosoma ad alta pressione. Questa fase prevede il processo di schiacciamento e appiattimento dei cromosomi utilizzando uno strumento Dremel e una morsa meccanica, nonché la visualizzazione cromosomica utilizzando un microscopio a contrasto di fase. La Figura 2 illustra l'ibridazione di una sonda marcata in fluorescenza per mirare al DNA sulle preparazioni dei vetrini cromosomici utilizzando un sistema automatizzato di colorazione dei vetrini, l'uso di un microscopio a scansione automatizzato per visualizzare e mappare le sonde dopo l'esperimento FISH e il posizionamento e l'orientamento di scaffold genomici sui cromosomi.

Le preparazioni di cromosomi politenici delle cellule dell'infermiera ovarica delle femmine di An. gambiae sono state realizzate utilizzando la tecnica dell'alta pressione. Questo metodo non danneggia né modifica la maggior parte della struttura cromosomica (Figura 3). Appiattisce i cromosomi piegati e, quindi, rivela bande sottili nascoste che non si vedono nelle preparazioni regolari (Figura 4).

Le sonde utilizzate in questo protocollo sono cloni genomici di DNA BAC ottenuti da una libreria ND-TAM BAC generata dal DNA del ceppo PEST di An. gambiae. Il DNA genomico per questa libreria è stato estratto da larve di primo stadio appena nate di entrambi i sessi. La Figura 5 mostra i risultati della FISH utilizzando cloni BAC ibridati con cromosomi politenici di An. gambiae. Questa procedura è stata eseguita utilizzando il sistema di colorazione automatizzata dei vetrini Xmatrx. Utilizzando una fotomappa citogenetica per An. gambiae¹⁰, due cloni di BAC, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) e BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), sono stati localizzati rispettivamente nelle suddivisioni 16C e 16D del braccio 2R. Tuttavia, la ricerca BLAST contro l'assemblaggio AgamP3 del ceppo PEST ^di An. gambiae AgamP3 ha identificato le sequenze omologhe a 102B24 e 142O19 nelle suddivisioni 16B e 17A del braccio 2R, rispettivamente (Tabella 1). Pertanto, la corrispondenza tra le coordinate genomiche e le suddivisioni citogenetiche può ora essere regolata in base ai nostri dati di mappatura. La ricerca BLAST contro gli assemblaggi del genoma di forma M e S di An. gambiae ha rilevato che i due cloni BAC si trovano in contigs diversi, ma negli stessi scaffold all'interno di ciascuna forma (Tabella 1). I contig identificati possono ora essere associati a specifiche posizioni cromosomiche. Inoltre, gli scaffold identificati possono ora essere correttamente orientati all'interno delle suddivisioni citologiche 16CD. È interessante notare che le distanze tra le sequenze 102B24 e 142O19 negli scaffold sono rispettivamente di 1.892.981 bp, 1.658.391 bp e 1.688.426 bp nel ceppo PEST, negli assemblaggi del genoma a forma M e a forma di S. Poiché il ceppo PEST è un ibrido tra le forme M e S, questa differenza è probabilmente dovuta a un assemblaggio errato del genoma PEST.

BAC
(adesione) Ceppo PEST
AgamP3

Coordinate M-form
contigs

Coordinate M-form
Ponteggi

Coordinate S-form
contigs

Coordinate S-form
Ponteggi

Coordinate 102B24
(BH372694) 2R:AAAB0100
8844_26 (16B)

43.681.342-
43.681.874 ABKP020247
53.1

32.513-
33.045 EQ090167.1

1.858.377-
1.858.909 ABKQ010123
32.1

4.299-
4.832 EQ099711.1

215.891-< BR /> 216.424 102B24
(BH372701) 2R:AAAB0100
8844_28 (16B)

43.788.213-< BR /> 43.788.969 ABKP020247
51.1

24.816-< BR /> 25.575 EQ090167.1,

1.772.683-
1.773.442 ABKQ010123
35.1

27.782-
28.540 EQ099711.1,

305.514-< BR /> 306.272 142O19
(BH368698) 2R:AAAB0100

8805_5 (17A)
45.428.580-
45.429.264 ABKP020247
01.1

2.499-
3.185 EQ090167.1

315.806-< BR /> 316.492 ABKQ010123
76.1

49.242-
49.942 EQ099711.1

1.791.625-
1.792.325 142O19
(BH368703) 2R:AAAB0100
8805_8 (17A)

45.560.099-
45.574.323 ABKP020220
17.1

30.971-< BR /> 32.469 EQ090167.1
200.518-< BR /> 202.016 ABKQ010123
79.1

27.760-
28.508 EQ099711.1

1.903.569-< > 1.904.317

Tabella 1. Risultati BLAST delle sequenze BAC-end contro gli assemblaggi del genoma di An. gambiae.

Figura 1. Rappresentazione schematica della preparazione dei cromosomi ad alta pressione. Le ovaie delle zanzare sono mostrate al corretto stadio di sviluppo.

Figura 2. Uno schema che rappresenta la FISH automatizzata, la scansione dei vetrini e la mappatura cromosomica degli scaffold genomici.

Figura 3. Una diffusione del cromosoma 3 politene di An. gambiae ottenuta utilizzando la tecnica ad alta pressione. 3L e 3R marcano i bracci sinistro e destro in corrispondenza dei telomeri. PH e IH indicano rispettivamente eterocromatina pericentrica e intercalare.

Figura 4. Confronto tra cromosomi politenici di An. gambiae preparati utilizzando la tecnica tradizionale (in alto) e ad alta pressione (in basso). Le immagini coprono le suddivisioni 29A-30E del braccio 3R (A) e 43D-46D del braccio 3L (B).

Figura 5. FISH di cloni BAC su cromosomi politenici di An. gambiae. A) Ibridazione di 102B24 (segnale rosso) con il braccio 2R. B) FISH bicolore di 102B24 (segnale rosso) e 142O19 (segnale blu) alle suddivisioni 16C e 16D del braccio 2R allungato, rispettivamente. Le frecce indicano i segnali di ibridazione dei cloni BAC marcati con Cy3 (rosso) e Cy5 (blu). C-la regione centromerica. a/+ mostra l'inversione dell'eterozigote 2La. I cromosomi sono stati controcolorati con il fluoroforo YOYO-1.

Discussione

La fase più critica della procedura ad alta pressione è il corretto schiacciamento delle cellule nutrici ovariche isolate al III stadio di sviluppo ovarico di Christopher¹³. Uno schiacciamento improprio può portare a cromosomi non sufficientemente diffusi, che possono causare problemi quando si cerca di determinare le posizioni delle sonde dopo la FISH. Se i cromosomi sono schiacciati eccessivamente, possono rompersi o allungarsi al punto da perdere i modelli di bande. La produzione di più vetrini dovrebbe portare a una coerenza quando si tenta di schiacciare i vetrini utilizzando lo strumento Dremel, il che aumenterà l'efficienza complessiva della produzione di vetrini. La tecnica ad alta pressione è stata sviluppata per la prima volta per le ghiandole salivari appena isolate di D. melanogaster⁹. Tuttavia, le ovaie delle zanzare vengono regolarmente conservate nella soluzione fissativa di Carnoy modificata (3 metanolo: 1 acido acetico glaciale in volume) prima di essere utilizzate per preparazioni cromosomiche. Pertanto, abbiamo modificato il protocollo ad alta pressione esistente per renderlo adatto ai cromosomi politenici delle cellule nutrici ovariche fisse della zanzara della malaria An. gambiae. Poiché l'alta pressione viene applicata utilizzando una morsa di precisione che possiede una superficie di lavoro altamente parallela dell'intera slitta, ci vuole molto meno tempo per preparare la zucca cromosomica rispetto all'utilizzo di una tecnica tradizionale di picchiettamento con una gomma da matita.

Altri passaggi importanti includono l'immersione sufficiente dei follicoli in acido propionico al 50% e il riscaldamento del vetrino. Entrambi questi passaggi sono essenziali per aiutare ad appiattire i cromosomi. Se vengono trascurati, i cromosomi possono apparire lucidi dopo la disidratazione, il che porta potenzialmente a una sovrabbondanza di fondo che può essere scambiata per un segnale nella FISH. Anche la tecnica di schiacciamento ad alta pressione funziona bene utilizzando le stesse soluzioni quando si preparano preparazioni cromosomiche mitotiche. L'ulteriore diffusione e appiattimento aiuta a esprimere meglio i cromosomi dai loro nuclei. L'aggiunta di una pressione uguale dovrebbe appiattirli di conseguenza per consentire misurazioni e potenzialmente una migliore risoluzione delle bande visibili dalla colorazione. I dettagli sull'isolamento dei cromosomi mitotici dalle zanzare sono riportati altrove¹⁵. Sebbene le preparazioni regolari di zucca siano sufficienti per molti scopi, tra cui la FISH ¹⁶ e l'immunocolorazione¹⁷, il metodo ad alta pressione non solo riduce la varianza potenziale da un vetrino all'altro, ma aumenta anche la qualità cromosomica complessiva, portando a un maggiore dettaglio durante la mappatura dei cromosomi. Questa procedura può essere utilizzata anche per preparare vetrini di membrana cromosomica in politene per la microdissezione a cattura laser.

Le limitazioni al metodo ad alta pressione includono la rottura del vetrino e l'eccessivo allungamento dei cromosomi. La rottura della slitta causata dall'applicazione di una sollecitazione eccessiva sulla slitta tramite la morsa è possibile, ma è limitata utilizzando le pressioni indicate nell'articolo. Per l'eccessivo allungamento dei cromosomi, se lo strumento Dremel viene applicato al vetrino per un lungo periodo di tempo, c'è la possibilità che i cromosomi possano allungarsi troppo e perdere la risoluzione. Questo può essere risolto applicando lo strumento per un breve periodo di tempo, controllando al microscopio e applicando più tempo con lo strumento Dremel se i cromosomi non sono sufficientemente diffusi.

Un protocollo FISH tradizionale include una serie di fasi di lavaggio e incubazione, che di solito durano 5-20 minuti e richiedono quasi la massima attenzione di un ricercatore per l'intera durata dell'esperimento. Inoltre, il numero di diapositive che possono essere gestite manualmente è solitamente limitato a poche diapositive in un determinato esperimento. Al contrario, un sistema automatizzato di colorazione dei vetrini esegue automaticamente tutte le fasi (tra cui lavaggio, incubazione, applicazione della sonda, denaturazione, ibridazione, applicazione e rimozione del vetrino coprioggetti). In questo modo si liberano fino a 6-8 ore lavorative per un ricercatore in un esperimento FISH. Inoltre, un sistema FISH automatizzato può aumentare significativamente la produttività. Ad esempio, il sistema Xmatrx è in grado di elaborare fino a 40 saggi su vetrini di preparazione singoli e fino a 80 saggi su vetrini di preparazione doppi contemporaneamente. Tra i limiti di questo sistema c'è il fatto che non è efficiente per un piccolo numero di esperimenti FISH in quanto richiede la preparazione di grandi volumi di soluzioni. Inoltre, il protocollo FISH programmato nel sistema può richiedere modifiche e aggiustamenti per nuove applicazioni.

Un sistema di scansione dei vetrini è una versione automatizzata di un microscopio a fluorescenza. Lo spostamento automatizzato del tavolino e un semplice pannello di controllo del microscopio liberano il tempo del ricercatore e rendono l'utilizzo del microscopio estremamente semplice. Ad esempio, il software del sistema di scansione ACCORD PLUS consente di acquisire facilmente più canali di fluorescenza e di gestire facilmente l'acquisizione delle immagini. Un esempio di ciò è l'inclusione dell'acquisizione z-stack, piuttosto che prendere una singola immagine; Il software acquisisce uno Z-stack configurabile di immagini per garantire che almeno un'immagine rimanga a fuoco. Sebbene questo sistema sia realizzato più per l'acquisizione di più immagini (molte cellule su un singolo vetrino), rende comunque molto più semplice la ricerca dei cromosomi sul vetrino rispetto alla navigazione manuale tra i vetrini.

Sia il sistema automatizzato di colorazione dei vetrini che il sistema di scansione sono utilizzati di routine per la diagnostica FISH di anomalie cromosomiche nelle cellule umane dalle cliniche di citogenetica. In questo studio, abbiamo sviluppato un protocollo che utilizza questi sistemi automatizzati per un'applicazione di ricerca di base. Il protocollo automatizzato di mappatura fisica ad alto rendimento può facilitare il rapido sviluppo di mappe cromosomiche fisiche per qualsiasi specie di interesse. Sebbene, in questo rapporto, abbiamo utilizzato i cromosomi politenici per la mappatura fisica, i cromosomi mitotici possono essere utilizzati anche con questi sistemi. Sarebbe utile che il protocollo fosse adattato ai cromosomi mitotici perché la maggior parte degli organismi non sviluppa cromosomi politenici leggibili. Tuttavia, i cromosomi politenici, quando disponibili, possono fornire informazioni utili sulla corrispondenza dei domini funzionali del genoma con la struttura cromosomica alla massima risoluzione. I principi organizzativi dei cromosomi politenici, come i modelli di bande e interbande, sono stati recentemente paragonati a quelli dei cromosomi regolari non politenici (interfase)¹⁸. Pertanto, la mappatura fisica dettagliata eseguita su preparazioni cromosomiche ad alta pressione ha il potenziale di collegare sequenze di DNA a specifiche strutture cromosomiche come bande, interbande, sbuffi, centromeri, telomeri ed eterocromatina; quindi, creando assemblaggi genomici basati sui cromosomi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrini coprioggetti per microscopio 22x22 mm Fisher		12-544-10
Vetrini coprioggetti per microscopio 18x18 mm	Fisher	12-553-402
Acido acetico	Fisher	A491-212
Metanolo	Fisher	A412-4
Acido propionico Utensile	Sigma-Aldrich	402907
Dremel 200 con albero flessibile attacco	Rand		3" Mini smerigliatrice da banco multiuso (con limitatore di velocità)
Appositamente progettato 200 μ l punte in plastica (bordi in plastica bordati) per utensile	Dremel Pipetman	F171300	Tagliare e riscaldare l'estremità grassa delle punte delle pipette
Morsa rapida rivestita di stagno	Avenger Gold Toolmaker	MTC-200-1	Rettificato di precisione quadrato e parallelo all'interno 0,00025
Chiave dinamometrica	Craftsman	44593
ThermoBrite Sistema di denaturazione/ibridazione a slitta	Abbott Molecular	30-144110
vetrini barriera da 25 mm	Abbott Molecular	XT108-SL
vetrini coprioggetti da 25 mm	Abbott Molecular	XT122-90X
Xmatrx Sistema automatizzato di colorazione dei vetrini	Abbott Molecular	08L46-001
MZ6 Stereomicroscopio Leica	Leica	VA-OM-E194-354	È possibile utilizzare un altro stereomicroscopio
Microscopio di fase Olympus CX41	Olympus	CX41RF-5	È possibile utilizzare un microscopio a fase diversa
Sistema di scansione automatizzato ACCORD PLUS	BioView (USA)	BV-5000-ACCP
10x PBS	Invitrogen	P5493
10% NBF (formalina tamponata neutra)	Sigma-Aldrich	HT501128
99% formamide	Fisher Scientific	BP227500
Destrano solfato sale sodico	Sigma	D8906
20x tampone SSC	Invitrogen	AM9765
Fosfato di sodio	Sigma-Aldrich	S3264
50x soluzione di Denhardt	Sigma-Aldrich	D2532
Azide di sodio	Sigma-Aldrich	S2002
1 mM YOYO-1 soluzione di ioduro (491/509) in DMSO	Invitrogen	Y3601
Reagente antisbiadimento ProLong Gold	Invitrogen	P36930
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Fermentas	R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP	GE Healthcare	PA53022, PA55022
BSA	Sigma	A3294
DNA polimerasi I	Fermentas	EP0041
DNasi I	Fermentas	EN0521