Circuiti neurali sono topograficamente organizzate in compartimenti funzionali con specifici profili molecolari. Qui, forniamo i passi pratici e tecnici per rivelare la topografia globale del cervello utilizzando un approccio versatile wholemount colorazione immunoistochimica. Abbiamo dimostrato l'utilità del metodo che utilizza il ben capito citoarchitettura e circuiti del cervelletto.
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Articolo metodologico
Immunoistochimica Wholemount per rivelare Topografia Cervello Complex
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'architettura ripetuto e ben compreso cellulare del cervelletto ne fanno un sistema modello ideale per esplorare la topografia del cervello. Alla base della sua citoarchitettura relativamente uniforme è una complessa serie di domini parasagittali del gene e l'espressione delle proteine. La compartimentazione molecolare del cervelletto si riflette l'organizzazione anatomica e funzionale delle fibre afferenti. Per apprezzare pienamente la complessità di organizzazione cerebellare in precedenza abbiamo affinato un approccio wholemount colorazione ad alto rendimento per l'analisi dei difetti di patterning nel cervelletto mouse. Questo protocollo descrive in dettaglio i reagenti, strumenti e misure pratiche che sono utili per rivelare con successo pattern di espressione delle proteine nel cervelletto topo adulto utilizzando immunostaining wholemount. I passaggi qui evidenziati dimostrare l'utilità di questo metodo utilizza l'espressione di zebrinII / aldolaseC come esempio di come la topografia sottile del cervello può essere rivelato nel suonativo conformazione tridimensionale. Anche descritto sono adattamenti al protocollo che permettono la visualizzazione di espressione della proteina in proiezioni afferenti e cervelletti grande per gli studi comparativi di topografia molecolare. Per illustrare queste applicazioni, i dati di colorazione afferente del cervelletto di ratto sono inclusi.
Protocollo
1. Animal perfusione e dissezione Cervelletto
- A seconda della proteina, perfusione può essere essenziale per 1,2 colorazione successo. Perfusione transcardiaca è invasivo, non la sopravvivenza procedura che richiede il corretto uso di anestetici. Corretta formazione, approvazione istituzionale, e l'approvazione IACUC sono tutte necessarie prima di tentare la procedura. E 'sempre una buona idea di consultare i veterinari dell'ente per ottenere aiuto per identificare i requisiti sperimentali e l'acquisizione di un corretto allenamento. Prima della procedura, l'animale deve essere profondamente anestetizzati e non risponde agli ....
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Discussione
Abbiamo descritto i dettagli tecnici necessari per la colorazione wholemount successo con un approccio versatile immunoistochimica per l'espressione delle proteine rivelatrici nel cervello in via di sviluppo e adulti. Usando questo approccio, complessi schemi di espressione molecolari possono essere analizzati e topografia cervello apprezzato senza la necessità di procedure tessuti laboriose e richiedono tempo sezionamento.
Questo protocollo è stato usato per rivelare l'espressione.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
RVS è sostenuta da investigatore nuova start-up fondi da Albert Einstein College of Medicine della Yeshiva University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiale | Funzione nel protocollo | ||
| Perfusione pompa (Fisher Scientific/13-876-2) | Consente di perfusione costante e lento. | ||
| Sharp punta-Forbici (FST/14081-08) | Uso generale della perfusione e dissezione. | ||
| Blunt-tip Pinza (FST/91100-12) | Per stabilizzare il cuore per l'inserimento dell'ago perfusione. | ||
| Pinza (FST da Dumont AA/11210-10) | Per l'uso durante la dissezione del cervello dal cranio e per separare il cervelletto dal resto del cervello. Questi sono essenziali perché hanno una punta leggermente arrotondata, che aiuta a minimizzare i danni al cervelletto durante la dissezione. | ||
| Nutator (Fisher Scientific) | Utilizzato per mantenere i tessuti in movimento durante i periodi di incubazione. | ||
| 1,5 ml di tubo (Sarstedt / Tappo a vite Micro Tube) | Tutte le fasi del suotochemistry protocollo si svolgono in questi microprovette. Il fondo arrotondato assicura che il cervelletto rimane in movimento. | ||
| Mestolo forato (FST/10370-17) | Usato per mantenere wholemounts nelle microprovette mentre delicatamente decantazione la soluzione esausta. | ||
| Leica MZ16 FA microscopio | Utilizzato per esaminare la colorazione wholemount. | ||
| Leica DFC3000 fotocamera FX | Permette di catturare immagini wholemount. |
Tabella 1.
| Calendario Esempio di un esperimento tipico wholemount | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Giorno 1 | Dent fix, temperatura ambiente, 8 ore | Dent candeggina, 4 ° C, overnight | ||||||
| Giorno 2 | 100% MeOH, temperatura ambiente, 2x, ogni 30 min | MeOH 100%, gelo / disgelo, 4x, 30 min/15 min | n = "2"> 100% MeOH, -80 ° C, overnight | |||||
| Giorno 3 | 50% MeOH/50% PBS, temperatura ambiente, 60-90 min | 15% MeOH / 85% PBS, temperatura ambiente, 60-90 min | 100% PBS, temperatura ambiente, 60-90 min | 10μg/mL proteinasi K in PBS, temperatura ambiente, 2-3 min | 100% PBS, temperatura ambiente, 3x, 10 min ciascuno | PMT, 4 ° C, overnight | ||
| Giorno 4-5 | PMT + 1 ° anticorpo + 5% DMSO, 4 ° C, 48 ore | |||||||
| Giorno 6 | PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 ore ciascuna | PMT + 2 ° anticorpo + 5% DMSO, 4 ° C, 24 ore (o iniziare fasi di amplificazione con ABC complesso) | ||||||
| 7 ° giorno | PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 ore ciascuna | PBT, temperatura ambiente, 2 ore | Incubare in DAB fresco in PBS fino colorazione ottimale è visualizzato | |||||
| Ricette (* = preparare fresca ogni volta) | |
|---|---|
| PBS (tampone fosfato salino) | 0.1M soluzione salina tampone fosfato in acqua deionizzata. pH 7.2 (Sigma compresse; P4417) |
| PFA (paraformaldeide) | Prodotto congelato e memorizzati come una soluzione al 20% e poi diluita al 4% in PBS per la soluzione di lavoro (Fisher Scientific, T353) |
| Dent Fissante 3 * | 4 parti di metanolo 1 parte dimetilsolfossido (DMSO, Fisher Scientific, D159-4) |
| Dent Bleach 3 * | 4 parti di metanolo 1 parte dimetilsolfossido (DMSO, Fisher Scientific, D159-4) 1 parte di perossido di idrogeno 30% |
| Digestione enzimatica | 10 ug / ml di proteinasi K (Roche Diagnostics; 03.115.828,001 mila) in PBS. |
| PBST | PBS contenente: 0,1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337, Triton può anche essere usato al posto di Tween-20 in tutti i casi). |
| PMT 25 * | PBS contenente: 2% senza grassi del latte scremato in polvere (Carnation preferito) 0,1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) |
| PBT 25 * | PBS contenente: 0,2% bovino (Sigma; B9001S) albumina sierica 0,1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) |
| DAB * | Sciogliere una compressa da 10 mg di 3,3-diaminobenzidina (Sigma-Aldrich, D5905) in 40 ml di PBS. Aggiungere 10 pl di perossido di idrogeno al 30% per iniziare la reazione). |
| ABC soluzione complessa | Vectastain kit (Vector Laboratories, Inc; PK-4000) |
Tabella 3.
Riferimenti
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount Immunohistochemistry: A high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. J. Histochem. Cytochem. 50, 235-244 (2002).
- Kim, S. -H., Che, P., Chung, S. -H., Doorn, D., Hoy, M., Larouche, M., Marzban, H., Sarna, J., Zahedi, S., Hawkes, R.
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Ristampe e permessi
