Purificazione di affinità di proteine marcate, in combinazione con la spettrometria di massa (APMS) è un potente metodo per la mappatura sistematica delle reti di interazione di proteine e per indagare la base meccanicistica dei processi biologici. Qui, descriviamo un ottimizzato sequenziale peptide affinità (SPA) APMS procedura sviluppata per il batterio Escherichia coli Che possono essere utilizzati per isolare e caratterizzare stabili multi-complessi proteici alla quasi omogeneità anche partendo da bassi numeri di copie per cellula.
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Articolo metodologico
Identificazione di complessi proteici in
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dal momento che la maggior parte dei processi cellulari sono mediate da assemblee macromolecolari, l'identificazione sistematica delle interazioni proteina-proteina (PPI) e l'identificazione della composizione subunità di multi-proteina complessi può fornire indicazioni in funzione del gene e migliorare la comprensione dei sistemi biologici 1, 2. Interazioni fisiche possono essere mappati con alta fiducia vialarge scala isolamento e caratterizzazione di complessi proteici endogeni in quasi fisiologiche condizioni basate su affinità purificazione di proteine cromosomicamente-tag in combinazione con la spettrometria di massa (APMS). Questo approccio è stato applicato con successo in organismi evolutivamente diverse, tra cui il lievito, mosche, vermi, cellule di mammifero, e batteri 1-6. In particolare, abbiamo generato un carbossi-terminale di affinità sequenziale Peptide (SPA) a doppio sistema di etichettatura per l'affinità per la purificazione complessi proteici autoctoni coltivati gram-negativi Escherichia coli, con genetically-trattabili ospitanti ceppi di laboratorio che sono particolarmente adatti per genoma indagini della biologia fondamentale e processi di conservazione di procarioti 1, 2, 7. Nostro SPA-tagging sistema è analogo al metodo di purificazione per affinità tandem originariamente sviluppato per il lievito 8, 9, e consiste di un legame peptidico calmodulina (CBP) seguito dal sito di clivaggio per la proteasi altamente specifico tabacco virus etch (TEV) e tre copie del FLAG epitopo (FLAG 3X), che consente per due turni consecutivi di arricchimento affinità. Dopo l'amplificazione cassetta, prodotti lineari sequenza-specifici della PCR che codifica per la SPA-tag e marcatore di selezione sono integrati ed espressi in cornice come carbossi-terminali fusioni in uno sfondo DY330 che è indotto ad esprimere transitoriamente un efficientissimo sistema di ricombinazione eterologa batteriofago lambda 10. Successiva dual-fase di purificazione utilizzando calmodulina e anti-FLAG perline affinità consente altamente selettivoe il recupero efficiente anche di complessi proteici a basso abbondanza di grandi culture. Spettrometria di massa tandem viene quindi utilizzato per identificare i stabilmente co-purificare proteine con elevata sensibilità (bassi limiti di rilevazione nanogrammi).
Qui, descriviamo dettagliate passo-passo le procedure usiamo comunemente per la codifica sistematica delle proteine, purificazione e di spettrometria di massa basata su analisi dei complessi proteici solubili da E. coli, che possono essere messe in scala e potenzialmente su misura per altre specie batteriche, tra cui alcuni patogeni opportunisti che sono suscettibili di recombineering. Le interazioni risultanti fisiche possono spesso rivelare interessanti elementi inaspettati e le connessioni che suggeriscono nuovi collegamenti meccanicistici. L'integrazione dei dati PPI con alternate dati di associazione molecolare come genetiche (gene-gene) interazioni e genomico-contesto (GC) previsioni può facilitare spiegazione della organizzazione globale molecolare di multi-proteina complessi all'interno di bipercorsi gici. Le reti generate per E. coli può essere utilizzato al fine di conoscere l'architettura funzionale di prodotti genici ortologhi in altri microbi per le quali le annotazioni funzionali attualmente mancano.
Protocollo
1. Costruzione di Gene-specifica SPA-tagging in E. coli DY330 Strain
- Il plasmide che comprende il pJL148 SPA-tag sequenza di DNA e l'antibiotico kanamicina cassetta marcatore di resistenza (Kan R) sono usati come stampo nella reazione a catena della polimerasi (PCR) 7. A 45 nt gene-specifico primer forward, situata immediatamente a monte del codone di stop gene bersaglio in frame con un bp 27 ('5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) innesco tag specifica avanti, e un 45 nt gene-specifico primer reverse, situata immediatamente a valle del codone di stop gene bersaglio in frame con un 27 bp (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCC....
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Risultati
Una volta purificati per affinità, da colture in fase esponenziale, i proteine esca marcate espresse a livelli endogeni, i campioni sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel colorato con argento per visualizzare i singoli componenti polipeptidici dei complessi stabili isolati. Abbiamo inoltre sottoposto una seconda aliquota dei campioni proteici purificati per affinità a spettrometria di massa tandem senza gel (LCMS) per identificare le corrispondenti sequenze polipeptidiche. L'efficacia di questa procedura APM.......
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Discussione
Un aspetto fondamentale della ZPS approccio APMS descritto qui è che la codifica viene effettuata all'interno del contesto naturale cromosomica, in modo da garantire la normale regolazione genica è mantenuto (ad esempio. Promotore esca nativo conservati, quindi i livelli di espressione non è perturbato) e nativo stabilmente associata a complessi proteici sono recuperati a quasi livelli endogeni. Questioni polarità operone inoltre sono evitati includendo un promotore rivolto all'esterno nel marcatore sel.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato con fondi della Fondazione canadese per l'innovazione, Genome Canada, l'Ontario Genomics Institute, il Ministero della Innovazione, e il Canadian Institutes of Health Research sovvenzione JG e AE The Red-esprime E. coli ceppo DY330 è stato un gentile dono da Donald L. Court (National Cancer Institute, Frederick, MD).
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Materiali
6. Apparecchiature per PCR e trasformazione8. Apparecchiature e reagenti per la sonicazione9. Reagenti e apparecchiature per la purificazione di affinità
td colspan="4">Beckman Coulter TJ-25 centrifuga Beckman Coulter TS-5.1-500 32 gradi <td colspan="4">td colspan="4"> di massa conici da 4 litri VWR#><89000-372 da 50 ml Any
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| I. Antibiotici | |||
| Kanamycin | Bioshop | #KAN201 | |
| Ampicillina | Bioshop | #AMP201 | |
| 2. Brodo formidabile medio | |||
| Bio-Triptone | Bioshop | #TRP 402 | |
| Estratto di lievito | Bioshop | #YEX 555 | |
| Glicerolo | Bioshop | #GLY 002 | |
| K2HPO4 | Bioshop | #PPM 302 | |
| KH2PO4 | Bioshop | #PPM 303 | |
| 3. Ceppo batterico e plasmide | |||
| DY330 | Yu et al. (2000)10 | ||
| pJL148 | Zeghouf et al. (2004)7 | ||
| 4. Reagenti per PCR ed elettroforesi | |||
| Taq DNA polimerasi | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 tampone PCR | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Caricamento colorante | NEB | #B7021S | |
| bromuro di etidio | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X tampone TBE | Thermo Scientific | #28355 | |
| Tris Base | Bioshop | #TRS001 | |
| acido borico | Bioshop | #BOR001 | |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | Sigma | # E6768 | |
| scala | DNA NEB | #N3232L | |
| 5. Kit di isolamento e pulizia dei plasmidi | |||
| Kit midi plasmidici | Qiagen | #12143 | |
| Kit di purificazione QIAquick PCR | Qiagen | #28104< | |
| Termociclatore | BioRad | iCycler | |
| Elettroforesi su gel di agarosio | BioRad | ||
| Elettroporatore | Bio-Rad | GenePulser II | |
| Cuvetta per elettroporazione da 0,2 cm | Bio-Rad | ||
| 42 ° C agitatore a bagnomaria | Innova 3100 | ||
| C Agitatore | New Brunswick Scientific, Stati Uniti | ||
| 32 C grande agitatore | New Brunswick Scientific, Stati Uniti | ||
| 32 Incubatore a piastre C | Fisher Scientific | ||
| 7. Elettroforesi e Western blotting | |||
| Acrilammide monomero, N,N'- metilenebis-acrilammide | Bio-Rad | #161-0125 | |
| Persolfato di ammonio | Bioshop | # AMP001 | |
| n-butanolo | Sigma | # B7906 | |
| TEMED | Bioshop | #TEM001 | |
| Whatman No. 1 carta da filtro | Fischer Scientific | #09-806A | |
| Mini proteiforme a 3 cellule | Bio-Rad | #165-3301 | |
| Dispositivo di trasferimento del gel iBlot | Invitrogen | #IB1001 | |
| Membrane nitrocellulosiche | Bio-Rad | #162-0115 | |
| Anticorpo monoclonale Anti-Flag M2 | Sigma | #F3165 | |
| Perossidasi di rafano | Amersham | #NA931V | |
| Pre-colorato standard di peso molecolare delle proteine | Bio-Rad | #161-0363 | |
| Reagente di chemiluminescenza | PIERCE | #1856136 | |
| Film per autoradiografia | Clonex Corp | #CLEC810 | |
| Quick Draw carta assorbente | Sigma | #P7796 | |
| Agitatore a dondolo con piattaforma C2 | New Brunswick Scientific, USA | ||
| Sonicator | Branson Ultrasonic | #23395 | |
| NaCl | Bioshop | #SOD001 | |
| Inibitori della proteasi | Roche | #800-363-5887 | |
| 0.5 mM TCEP-HCl | Thermo Scientific | #20490< | |
| 0,8 x 4 cm Colonna in polipropilene Bio-Rad | Bio-Rad | #732-6008 | |
| Benzonasi nucleasi | Novagen | #70746 | |
| Perle di agarosio Anti-FLAG M2 | Sigma | #A2220 | |
| Perle di calmodulina-sefarosio | GE Healthcare | #17-0529-01 | |
| TEV proteasi | Invitrogen | #12575-015 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| CaCl2 | Sigma | #C2661 | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| LabQuake Shaker | Thermolyne | #59558 | |
| 10. Reagenti per la colorazione dell'argento | |||
| Metanolo | Bioshop | #MET302 | |
| Acido acetico | Bioshop | t#ACE222 | |
| Sodio-tiosolfato | Sigma | #S-7143 | |
| Nitrato d'argento | Fischer Scientific | #S181-100 | |
| Formaldeide | Bioshop | #FOR201 | |
| Carbonato | di sodioBioshop | #SOC512 | |
| 11. Reagenti e apparecchiature per l'identificazione delle proteine | |||
| tripsina oro, grado di spettrometria di massa | Promega | # V5280 | |
| 50 mM NH4HCO3 | Bioshop | #AMC555 | |
| 1 mM CaCl2 | Bioshop | #CCL302 | |
| Acetonitrile | Sigma | #A998-4 | |
| Formico acido | Sigma | #F0507 | |
| acqua di grado HPLC | Sigma | #95304 | |
| Iodoacetamide | Sigma | #16125 | |
| Millipore Zip-Tip | Millipore | # ZTC18M960 | |
| ~10 cm di 3 μ m Luna-C18 resina | Phenomenex | ||
| Proxeon nano pompa HPLC | Thermo Fisher Scientific | ||
| LTQ Orbitrap Velos spettrometro | Thermo Fisher Scientific | ||
| 12. Flaconi | |||
| Flaconi conici | VWR | #89000-372 | |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 ml | Vendor | ||
| Flak conici da 250 ml | VWR | #29140-045 | |
| Provette sterili per coltura da 15 ml | Thermo Scientific | #366052 | |
| Fiale criogeniche | VWR | #479-3221-80 | |
| C congelatore | Fisher Scientific | #13-990-14 | |
| Sistema di vuoto a velocità | Thermo Scientific | ||
| Tamponi e soluzioni 1. 1 litro di brodo terrificante (TB) media 11 g Bio-Tryptone 2. Soluzione madre di sale di potassio 1.5 M K2HPO4 3. Tampone di sonicazione 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 4. Tampone AFC 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 5. Tampone di scissione TEV 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 6. Tampone legante la calmodulina 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 7. Tampone di lavaggio Calmodulina 30 mM Tris-HCl pH 7.9 8. Tampone di eluizione della calmodulina 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 9. Soluzione di sviluppo (1L) 37% Formaldeide 10. Tampone di digestione 50 mM NH4HCO3 11. Soluzione di bagnatura ed equilibratura 70% acetonitrile (ACN) in acido formico allo 0,1% 12. Soluzione di lavaggio 100% H2O in acido formico 0,1% |
Riferimenti
- Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
- Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of ....
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Ristampe e permessi
