Descriviamo il metodo di prototipo per la produzione di vetrini al microscopio a fluorescenza rivestite con gelatina per la visualizzazione invadopodia-mediata degradazione della matrice. Tecniche di calcolo utilizzando il software disponibile sono presentati per quantificare i livelli risultanti di proteolisi matrice di singole cellule all'interno di una popolazione mista e per gruppi multicellulari che comprende interi campi microscopici.
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Articolo metodologico
Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari
In questo articolo
Sommario
Abstract
Invasione cellulare nei tessuti locali è un processo importante nello sviluppo e omeostasi. Invasione Malregulated e il movimento delle cellule successiva è caratteristica di molteplici processi patologici, tra cui l'infiammazione, le malattie cardiovascolari e le metastasi delle cellule tumorali 1. Degradazione proteolitica focalizzata di matrice extracellulare (ECM), componenti della membrana basale epiteliale o endoteliale è un passo fondamentale nel dare inizio invasione cellulare. Nelle cellule tumorali, ampia analisi in vitro ha determinato che il degrado ECM si ottiene ventrali actina ricchi di strutture a membrana protrusione chiamati invadopodia 2,3. Forma Invadopodia in stretta apposizione della ECM, dove moderare ripartizione ECM attraverso l'azione di metalloproteinasi della matrice (MMP). La capacità delle cellule tumorali di formare invadopodia correla direttamente con la capacità di invadere stroma locale e componenti associati vascolari 3. _content "> Visualizzazione di invadopodia-mediata degradazione ECM delle cellule mediante microscopia a fluorescenza con colorante marcati con proteine della matrice rivestite su vetro coprioggetti è emerso come la tecnica più diffusa per valutare il grado di proteolisi matrice e cellulari potenziale invasivo 4,5. Qui descriviamo una versione del metodo standard per generare vetrini fluorescenza etichettati utilizzando un comune Oregon verde-488 coniugato gelatina. Questo metodo è facilmente scalata per produrre rapidamente un elevato numero di vetrini coprioggetto rivestiti. Mostriamo alcuni degli artefatti comuni microscopici che spesso si incontrano durante questa procedura e come questi possono essere evitati. Infine, si descrivono metodi standardizzati software prontamente disponibile per consentire la quantificazione della degradazione della matrice gelatinosa etichettati mediata da cellule singole e intere popolazioni cellulari. Le procedure descritte consentono di monitorare accurato e riproducibile invadopodiaattività, e può anche servire come una piattaforma per la valutazione dell'efficacia di espressione della proteina modulante o prove di anti-invasivi composti sulla degradazione della matrice extracellulare in impostazioni singole e multicellulari.
Protocollo
1. Produzione di Oregon verde coprioggetto rivestiti 488-gelatina
- Preparare un marcato 5% (w / w) stock gelatina / soluzione di saccarosio con l'aggiunta di 1,25 g di gelatina e 1,25 g di saccarosio in PBS fino ad un volume finale di 50 ml. Riscaldare la soluzione di gelatina magazzino a 37 ° C ed assicurare che sia completamente sciolto prima dell'uso. Conservare la miscela finale a 4 ° C.
- Pulire diametro di 13 mm # 1 vetrini coprioggetto ponendo un individuo in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti di plastica coltura tissutale. Aggiungere 500 pl di 20% di acido nitrico in ciascun pozzetto e incubare per 30 min. Aspirare la solu....
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Discussione
La possibilità di visualizzare le cellule che degradano la matrice extracellulare ha aiutato a scoprire i meccanismi molecolari impiegati nelle prime fasi di invasione cellulare. Lanciato da Wen-Tien Chen nei primi anni 1980 4,14,15, rivestimento proteine fluorescenti marcate extracellulari su vetrini per la successiva analisi al microscopio è emerso come la tecnica principale nella valutazione della funzione invadopodia in una vasta gamma di tipi di cellule. Il protocollo prescritto viene illustrato il met.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di dotazione della West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Ringraziamo Susette Mueller (Georgetown University) e Laura Kelley per la consulenza precoce e assistenza. L'uso dello strumento di imaging Virginia Occidentale Microscopia University (supportato dal Babb Mary Randolph Cancer Center e, sovvenzioni NIH RR16440 P20, P30 e P30 RR032138 GM103488) è riconosciuto con gratitudine.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente / strumento | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| gelatina | Sigma | G1890 | Suini pelle |
| saccarosio | Pescatore | BP220 | |
| Coprioggetto 12 millimetri | Pescatore | 50-121-5159 | |
| Piastre da 24 pozzetti | Pescatore | 08-772-1 | BD Falcon |
| acido nitrico | Ricca | R5326000 | Soluzione al 20% |
| poli-L-lisina | Scienze della microscopia elettronica | 19320-B | 0,1% soluzione |
| glutaraldeide | Sigma | G7526 | Soluzione 8% |
| Oregon verde 488-coniugato gelatina | Invitrogen | G-13186 | |
| sodio boroidruro | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Pescatore | BP151 | |
| rodamina-falloidina | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anticorpo anti-FLAG | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 di capra anti-IgG di topo | Invitrogen | A21235 | |
| Prolong antifade Oro | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 microscopio confocale | Zeiss | ||
| ImageJ software | Di dominio pubblico | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cibernetica | ||
| NIS Elements | Nikon |
Riferimenti
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder,....
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Ristampe e permessi
