Un protocollo spettrofluorimetrico per la misura della permeabilità mitocondriale apertura dei pori di transizione nel cuore topo mitocondri isolati è presentato qui. Il test prevede la misurazione simultanea dei mitocondri Ca 2 + Manipolazione, volume potenziale di membrana mitocondriale e mitocondriale. La procedura per ottenere il cuore di alta qualità e funzionale mitocondri è anche descritto.
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Articolo metodologico
Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mtPTP) è un canale non specifica che forma nella membrana mitocondriale interna per trasportare soluti con una massa molecolare inferiore a 1,5 kDa. Anche se l'identità definitiva molecolare del poro è ancora in discussione, proteine come cyclophilin D, VDAC e ANT contribuire alla mtPTP formazione. Mentre il coinvolgimento di apertura mtPTP nella morte cellulare è ben definito 1, accumulando prove indicano che la mtPTP serve un ruolo fisiologico durante mitocondriale omeostasi Ca 2 + 2, bioenergetica e redox di segnalazione 3.
apertura mtPTP è innescata da matrice Ca 2 +, ma la sua attività può essere modulata da diversi altri fattori come stress ossidativo, adenina nucleotide esaurimento, alte concentrazioni di Pi, depolarizzazione della membrana mitocondriale o sganciamento, e acidi grassi a catena lunga 4. In vitro, mtPTP apertura può essere achieved aumentando la concentrazione di Ca 2 + all'interno della matrice mitocondriale mediante aggiunte esogene di Ca 2 + (capacità di ritenzione di calcio). Quando i livelli di Ca 2 + nei mitocondri raggiunge una certa soglia, il mtPTP apre e facilita Ca 2 + rilascio, la dissipazione della forza motrice protonica, crollo potenziale di membrana ed un aumento di volume della matrice mitocondriale (gonfiore) che conduce infine alla rottura del membrana mitocondriale esterna e perdita irreversibile della funzione organello.
Qui si descrive un saggio fluorimetrico che permette una caratterizzazione completa di apertura mtPTP nel cuore topo mitocondri isolati. Il test prevede la misurazione simultanea dei tre parametri mitocondriali che vengono alterati quando apertura mtPTP verifica: mitocondriale Ca 2 + movimentazione (assorbimento e rilascio, misurata dalla concentrazione di Ca 2 + nel mezzo di saggio), il potenziale di membrana mitocondriale, e mitochoVolume ndrial. I coloranti impiegati per la misurazione Ca 2 + nel mezzo di saggio e il potenziale di membrana mitocondriale sono Fura FF, un impermeant membrana, indicatore raziometrico che subisce uno spostamento della lunghezza d'onda di eccitazione in presenza di Ca 2 +, e JC-1, un cationico, Indicatore raziometrico che costituisce monomeri verdi o rosse aggregati al potenziale di membrana a bassa e alta, rispettivamente. Variazioni di volume mitocondriale sono misurata registrando diffusione della luce dalla sospensione mitocondriale. Dal momento che di alta qualità, i mitocondri funzionale sono necessari per il test di apertura mtPTP, abbiamo anche descrivere i passi necessari per ottenere intatta, cuore altamente accoppiato e funzionale mitocondri isolati.
Protocollo
1. Isolamento dei mitocondri di cuore di topo
- Per isolare il cuore mitocondri, anestetizzare e sacrificio topi secondo le procedure approvate dal locale Cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso.
Nota: Tutte le fasi del protocollo di isolamento mitocondri deve essere eseguita su ghiaccio. Usare tamponi di ghiaccio freddo e pre-refrigerati Petri, Falcon tubi e tubi Eppendorf. I volumi stabiliti nel protocollo sono per un campione contenente 2 cuori di topo.
- Rimuovere i cuori, metterli in acqua fredda Buffer Isolamento mitocondri (300 saccarosio mM, 10 mM Na-HEPES, ....
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Discussione
Il protocollo qui presentato descrive i passi necessari per valutare sperimentali transizione di apertura permeabilità pori nel cuore mitocondri isolati (Figura 1 e Figura 4): la procedura per isolare cuore topo mitocondri, i controlli respiratori che assicurano l'integrità e la funzionalità, i parametri monitorati durante mitocondriali mtPTP apertura ed i coloranti utilizzati per la loro misurazione, la costituzione della strumentazione spettrofluorimetrico, e la caratterizzazione .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da HL094536 (BJH).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T3030 | |
| Inibitore della tripsina (soia) | Sigma-Aldrich | T9128 | |
| Sodio hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Citocromo c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Alameticina | Sigma-Aldrich | A4665 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Ciclosporina A | Calbiochem | 239835 | |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 | |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 | |
| Tissue-grinder Potter Elvehjem con pestello in Teflon 15 ml | Wheaton Industries | ||
| Agitatore ad asta | Wheaton Industries | 903475 | |
| Oxytherm (elettrodo di ossigeno a temperatura controllata) | Hansatech Instruments | ||
| QuantaMaster 80 spettrofluorimetro doppia emissione | Photon Technology International, Inc. |
Riferimenti
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D.
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Ristampe e permessi
