Profiling completa del regolamento dopamina nel substantia nigra e ventrale tegmentale Area

Sommario

La dopamina è distintamente regolata nel mesencefalo nuclei, che contengono la cella corpi e dendriti dei neuroni dopaminergici. Qui si descrive un approccio di dissezione e di manipolazione dei campioni per massimizzare i risultati e, quindi, le conclusioni e le intuizioni, sulla regolamentazione dopamina nel mesencefalo nuclei della substantia nigra (SN) e la zona ventrale tegmentale (VTA) in roditori.

Abstract

Dopamina è un neurotrasmettitore vigorosamente studiato nel SNC. Infatti, il suo coinvolgimento in attività locomotoria e la ricompensa comportamento correlato ha favorito cinque decenni di inchiesta sulle carenze molecolari associati con regolazione della dopamina. La maggior parte di queste indagini di regolazione della dopamina nel cervello, la messa a fuoco sulla base molecolare per la sua regolamentazione nel campo delle regioni terminali dei percorsi nigrostriatali e mesoaccumbens, striato e nel nucleo accumbens. Inoltre, tali studi si sono concentrati sull'analisi del tenore di tessuto dopamina con normalizzazione a un solo peso del tessuto bagnato. Indagine delle proteine ​​che regolano la dopamina, come la tirosina idrossilasi (TH) di proteine, fosforilazione TH, trasportatore della dopamina (DAT), e vescicolari trasportatore monoamine 2 (VMAT2) proteina spesso non includono l'analisi del tenore di tessuto dopamina nello stesso campione. La capacità di analizzare sia il contenuto della dopamina dei tessuti e delle sue proteine ​​di regolazione (compresa la post-tramodifiche nslational) non solo dà potere intrinseco di interpretare il rapporto della dopamina con il livello di proteine ​​e la funzione dei TH, DAT, o VMAT2, ma si estende anche all'economia del campione. Ciò si traduce in un costo minore, e tuttavia produce approfondimenti nel regolamento molecolare di dopamina in qualsiasi paradigma di scelta degli investigatori.

Ci concentriamo le analisi nel mesencefalo. Anche se il SN e VTA sono in genere trascurati nella maggior parte degli studi di regolazione della dopamina, questi nuclei sono facilmente sezionato con la pratica. Una lettura completa di tenore di tessuto dopamina e TH, DAT, o VMAT2 può essere condotto. Vi è fiorente letteratura sull'impatto della funzione della dopamina nel SN e VTA sul comportamento, e le impingements di sostanze esogene o di processi di malattia ivi ^1-5. Inoltre, i composti come fattori di crescita hanno un effetto profondo sulla proteine ​​dopamina e dopamina-regolazione, in misura relativamente maggiore nella SN o VTA Si illustrerà la tecnica di dissezione per separare questi due nuclei e il trattamento del campione di tessuto sezionato che produce un profilo rivelando meccanismi molecolari di regolazione dopamina in vivo, specifici per ogni nuclei (Figura 1).

Protocollo

1. Dissezione

1. Su un letto di wet-ghiaccio, raffreddare una matrice cervello dei roditori (sezioni coronali segregato 1 millimetro di distanza), una capsula di Petri contenente 5 rasoi, e un bisturi # 11. In un contenitore separato, posto etichettato tubi microcentrifuga da 2 ml di grandezza in ghiaccio secco.
2. Il ricercatore scegliere il metodo di eutanasia. Abbiamo risultati riproducibili effettuazione di una anestesia molto breve con isoflurano, idealmente, un vaporizzatore deve essere usato. Tuttavia, se non disponibile, si usa una batteria grande giara contenente una piattaforma. Con il vaso della batteria si trova in una cappa di ventilazione approvato, inserire un isoflurano satura di garza sotto la piattaforma e aspettare 3-5 minuti per consentire l'isoflurano per saturare il vaso della batteria. Posizionare il ratto dentro e rimuovere per decapitazione, non appena il topo ha perso conoscenza. Rimuovere rapidamente il cervello (idealmente in meno di due minuti), sciacquare sotto l'acqua fredda, e posizionare immediatamente nella matrice fredda cervello dei roditori.
3. Un minuto dopo la posizioneIng il cervello nella matrice, inserire lame fredde nel cervello raffreddato, a partire circa 2 mm anteriore del chiasma ottico se il corpo striato e nel nucleo accumbens sono desiderati per l'analisi in aggiunta ai nuclei mesencefalo. Continuare inserisce lamette freddo con ciascuna sezione 1 mm fino ad arrivare a metà del ponte, sfalsando il posizionamento di ogni lama di rasoio successivo in modo da facilitare facile rimozione di ogni singola lama.
4. Quando si estrae il rasoio, e cercare l'inizio dell 'ippocampo. Quando è completamente avvolto attorno al mesencefalo, cominciano a prendere sezioni utilizzando la # 11 bisturi, come illustrato in figura 2.
5. Disporre il tessuto sezionato nel pre-raffreddata provetta per microcentrifuga sul ghiaccio secco. Nel ratto, si aspettano di essere in grado di sezionare SN e VTA da un minimo di due fette coronali e un massimo di tre. Tessuti Conservare a -80 ° C fino al momento per l'elaborazione.

2. Tissue Analysis: HPLC fo dopamina e metaboliti

Per informazioni complete sulla attrezzatura HPLC e manutenzione, riferirsi all'analisi HPLC, alla fine del manoscritto.

1. Delicatamente omogeneizzare tessuto immediatamente dopo la rimozione dal ghiaccio secco utilizzando ghiacciata 0,1 M HClO _4-EDTA (0,1 M HClO ₄ e 0,1 mM EDTA) ^9, che contiene N-metil dopamina ad una concentrazione di 20 ng / mL, che funge uno standard interno per il recupero del campione durante l'analisi HPLC. L'omogeneizzatore che usiamo è un Sonifier Branson 150, con l'impostazione al 10% della potenza totale (1 su 10). I volumi sonicazione si consigliano:
   Nel ratto, SN = pl 250 (dissezione unilaterale), 400 microlitri (dissezione bilaterale), VTA = 200 (dissezione unilaterale) ul, 400 ul (dissezione bilaterale).
   In mouse, (dissezioni bilaterali solo), SN = 200 microlitri, VTA = 200 pl.
2. Dopo l'omogeneizzazione, di contenere campioni in ghiaccio secco. I campioni sono poi centrifuged (DuPont Sorvall MicroSpin 24S) a 12.000 RPM per sedimentare la proteina pellet da utilizzare per determinazioni western blot. I supernatanti vengono iniettati direttamente nel HPLC. I volumi di iniezione sono raccomandati per l'analisi precisa nel ratto o il mouse: (. Sia da prep) SN = 150 (. Sia da prep), VTA = 160 microlitri
3. Lo standard archivio viene preparata a 1 mg / ml aggiungendo la quantità appropriata di monoammine e metaboliti * di componente dopamina a 0,1 M di acido perclorico 0,1 mM EDTA. La concentrazione di ogni composto è di 1 mg / ml eccetto triptofano che è 5 mg / ml. Lo standard stock è diviso in 10 aliquote pl e memorizzati nel bassissimo fino a quando necessario.
   * Tutti i pesi sono corretti per la forma di sale del composto, se applicabile.
   Preparare lo standard di lavoro diluendo una aliquota di 10 microlitri di standard di scorta a 100 ml di soluzione di acido perclorico. La concentrazione dello standard di lavoro è 0,1 ug / ml eccetto triptofano che è 0,5 ug / ml. 50 pl diquesto standard di lavoro viene iniettato nel HPLC per un on-column quantità di 5 ng di ciascun componente, tranne triptofano che è di 25 ng.
4. Determinazione del recupero della dopamina nel frazionamento del campione:
   Ci sono diversi passaggi coinvolti per determinare il recupero della dopamina da un frazionamento del campione.
5. In primo luogo, dividere l'altezza della dopamina picco del campione per l'altezza del picco dello standard dopamina e moltiplicare questo rapporto per l'importo totale (ng) di dopamina nello standard. La nostra concentrazione di dopamina standard è 0,1 microlitri ng / ul e 50 della norma viene analizzato. Pertanto, la quantità di dopamina nel standard è 5 ng. Pertanto, la seguente equazione può essere utilizzato per determinare il recupero dopamina in un dato campione:
   (Altezza del picco dopamina nel campione / altezza del picco di dopamina in standard) * 5 ng
6. Correzione per la perdita del campione utilizzando lo standard interno N-metil dopamina:
   L'effettivo recupero di N-metil dopamina è calcolato nello stesso modo dopamina dividendo il N-metil dopammina altezza di picco nel campione da N-metil altezza picco dopamina dello standard e questo rapporto moltiplicando la quantità totale (ng) di N-metil dopamina nello standard. Come la dopamina, il nostro standard di N-metil concentrazione di dopamina è di 0,1 ng / ul. 50 pl della norma viene analizzato. Pertanto, la quantità di N-metil dopamina nello standard è di 5 ng. Pertanto, la seguente equazione può essere utilizzato per determinare N-metil recupero dopamina in un dato campione:
   (N-metil altezza picco dopamina nel campione / N-metil altezza picco dopamina in standard) * 5ng
   Tuttavia, poiché la N-metil dopamina in ciascun campione non proviene dal campione stesso, ma dal buffer HPLC, la quantità di N-metil dopamina previsto in ciascun campione viene calcolata. L'N-metil concentrazione di dopamina in tampone HPLC è 20 ng / ml o 0,02 ng / mL, quindi la quantità prevista di N-metil dopamina in ciascun campione è trovato moltiplicando il N-metil concentrazione dopamina del buffer HPLC dal volume aliquota di ciascun campione utilizzato per HPLC analisi. Ciò è illustrato nel seguente equazione:
   (0,02 ng / pl) * (volume di aliquota di campione utilizzato per l'analisi HPLC)
7. La differenza tra l'atteso e recuperato N-metil dopamina può quindi essere utilizzato per correggere l'per la quantità di dopamina recuperato regolando per qualsiasi perdita del campione. Basta prendere il rapporto di atteso N-metil dopamina / recuperato N-metil dopamina e moltiplicare tale dalla quantità di dopamina recuperato. Pertanto, l'equazione generale per la quantità di dopamina in un'aliquota di campione è il seguente:
   (Altezza del picco dopamina nel campione / dopamina altezza picco in standard) * (N-metil altezza picco dopamina in standard / N-metil altezza picco dopamina nel campione) * (0,02 ng / pl) * (volume di aliquota di campione utilizzato per l'analisi HPLC )
8. Dopamina totale recuperata da un campione:
   Il valore di dopamina recuperato da un frazionamento del campione viene poi utilizzato per estrapolare la quantità totale di dopamina in un dato campione. Ciò viene fatto dividendo l'importo recuperato (ng) of DA dal volume aliquota e moltiplicando questo valore per il volume totale del tampone HPLC che il campione è stata sonicata, questa fase è dato dalla seguente equazione:
   (Quantità (ng) di dopamina in aliquota / volume di frazionamento del campione) * (volume totale di tampone HPLC in cui è stata sonicata campione).
   Il lettore si riferisce ai seguenti studi ^2,4,10 per una presentazione completa della valutazione dei metaboliti della dopamina e in collaborazione con letture di dopamina in proteine ​​che regolano non solo SN e VTA, ma striato e nucleo accumbens pure.

3. Tissue Analysis: Total normalizzazione delle proteine ​​e finale dei risultati TH e DAT

1. Posizionare i pellets proteina precipitata (derivante dal trattamento tampone HPLC) in ghiaccio, per mantenere 4 ° C. Assicurarsi che tutti i buffer è stato rimosso e archiviati (se l'analisi di conferma è richiesto). Se il SN o VTA deve essere lavorato bilateralmente (ratto solo), aggiungere 300 microlitri (SN) o 200 pl (VTA) del 1% SDS contenente 5 mM Tris (pH 8,3) e 1 mM EDTA a pellet e sonicare. Aggiungere 150 microlitri della soluzione di SDS al SN pellets o 100 ul a pellet VTA Se l'elaborazione di tessuti da dissezioni unilaterali.
2. Porre i campioni in prossimità di acqua bollente per ~ 5 minuti per completare denaturazione delle proteine ​​e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Assicurarsi che i tappi sono saldamente in questa fase.
3. Determinare concentrazione di proteina nel campione usando il saggio BCA, compresa una curva standard proteina (standard albumina) nell'intervallo 2-40 pg di proteina. Assay volume di 5 microlitri del campione in triplicato e usare il valore mediano per determinare quantità di proteina contro la curva standard. Dividere per il volume di saggio di concentrazione di proteina. Nota: questo è il primo dei due provvedimenti adottati per normalizzare TH totale, DAT, e VMAT2 risultati per il recupero delle proteine ​​totali.
4. Preparare i campioni con tampone campione (contenente ditiotreitolo) per ridurre SDS-elettroforesi su acrilamide g 10%els. Idealmente, la concentrazione finale di proteine ​​totali dovrebbe essere ~ 2 pg / pl. La ragione di questa selezione concentrazione è di ridurre il volume del campione necessaria per la determinazione finale di fosforilazione TH, come ~ 100 pg di proteina totale sarà necessario per il caricamento quantificare precisamente ser31 e ser40 fosforilazione TH. Se il colore giallo è visto nel campione dopo l'aggiunta di tampone del campione, il campione è troppo acido. Aggiungere 1 M Tris (pH 8.2) con incrementi di 10 pl fino a quando il colore blu viene ripristinato.
5. Preparare i campioni come segue per le seguenti determinazioni di dopamina-proteine ​​che regolano:
6. TH: contro uno standard calibrato per la proteina TH (come ng), la concentrazione di TH (TH come per ng ​​per pg di proteina totale) in SN dovrebbe variare da ~ 0,05-0,27 TH ng per pg di proteina totale di ^{2,4, 7,10,11.} Contro una curva TH lineare standard, che vanno 0,5-5,0 ng TH e l'utilizzo di anticorpo primario TH (cat Millipore # AB152, diluizione 1:1000 in PVP T-20 Soluzione bloccante) che produce una curva standard lineare, il carico ottimale di proteine ​​totali del SN dovrebbe essere ~ 10 ug. La concentrazione di TH nella VTA varia da ~ 0,4-1,0 ng TH per ^4,11 mg di proteine. Pertanto, il carico di proteine ​​totali per VTA dovrebbe essere ~ 5 pg.
7. DAT: Le quantità relative di DAT a SN o VTA sono significativamente inferiore a quella delle regioni affini campo terminali di striato e nucleo accumbens ^4. L'espressione relativa del DAT come normalizzata alle proteine ​​TH recuperata è anche significativamente più bassi nei SN e VTA. Di conseguenza, i carichi di proteine ​​per la quantificazione delle proteine ​​DAT in SN o VTA devono essere molto maggiore rispetto ai carichi di esempio delle regioni terminali del campo. Un minimo di 30 pg di proteina totale è necessaria per la precisione nella valutazione DAT in VTA e un carico nominale di 50 pg di proteina totale è necessità di una valutazione del SN. L'anticorpo primario utilizzato è Santa Cruz, cat # sc-1433.
8. VMAT2: L'espressione della VMAT2, Come normalizzato alle proteine ​​totali, è maggiore nelle regioni che mesoaccumbens nigrostriatali. Tuttavia, rispetto all'espressione TH, espressione VMAT2 è maggiore in SN e almeno in striato ^4. Utilizzo di Santa Cruz cat # sc-15314, un carico nominale di proteine ​​totali di circa il 40 mcg di essere la migliore per la quantificazione del VMAT2.
9. Eseguire la quantità adeguata di proteine ​​totali tramite SDS-PAGE su gel di acrilammide al 10%. Il Bio-Rad Protean II unità elettroforesi viene utilizzata per le determinazioni, che è un gel grande formato. Trasferire le proteine ​​su nitrocellulosa 0,45 micron dimensione dei pori. Per il trasferimento, un serbatoio Hoeffer impostata su almeno 27 Volt permette il trasferimento avrà luogo durante la notte.
10. Lasciare le macchie asciugare per almeno 30 minuti e poi macchia con soluzione Ponceau S (1% Ponceau S in 5% di acido acetico glaciale) per ~ 5 minuti. De-macchia vigorosamente con lo 0,2% di soluzione di HCl fino a bande proteiche individuali chiaramente risolvere e la colorazione di fondo è stato rimosso. Ottenere un'immagine del Ponceau S macchiaing con J l'immagine per quantificare ulteriormente i carichi di proteine ​​rispetto in ogni corsia e normalizzare TH, DAT, o VMAT2 risultati (Figura 3).

4. Tissue Analysis: sito-specifica fosforilazione TH

La fosforilazione di TH a ser31 ser40 può aumentare o L-DOPA biosintesi delle catecolamine in cellule ^12. Sebbene la quantità di fosforilazione in ogni sito necessario per aumentare la L-DOPA biosintesi in regioni cerebrali dopaminergici come SN e VTA non viene stabilita, è evidente che ser31 fosforilazione gioca un ruolo importante nella regolazione L-DOPA biosintesi ¹⁰ e co-varia con DA tenore di tessuto tra lo striato, il nucleo accumbens, SN e VTA ^{2, 10.} Tuttavia, l'inclusione di ser40 sono necessarie determinazioni, in quanto numerosi studi mostrano che può influenzare l'attività TH, in particolare se una soglia di fosforilazione è raggiunto il ^12.

Mentre ser19 phosphorylatinon influisce sulla attività TH solo ^13,14, può essere considerato un sentinella Ca ^{2 +-dipendente} segnalazione nel neurone DA, dato che extracellulare Ca ^{2 +} è necessario aumentare ser19 fosforilazione in condizioni depolarizzando ^12. Inoltre, vi è una significativa correlazione positiva con la fosforilazione di ser19 ser31 fosforilazione solo nel SN e VTA ^10, a significare che ser19 stato di fosforilazione potrebbero influenzare ser31 fosforilazione, e quindi, indirettamente L-DOPA biosintesi.

Considerazioni Esempi di carico ottimale per la quantificazione del site-specific stechiometria TH fosforilazione: Di seguito, le considerazioni necessarie per le determinazioni accurate e precise di site-specific fosforilazione TH nei tessuti sezionati è presentato. Quando possibile, uno standard di fosforilazione calibrato TH dovrebbero essere inclusi nella valutazione di fosforilazione campione TH. Il carico campione deve tener accstechiometria ount inerente a ciascun sito di fosforilazione in modo che il saggio di fosforilazione quantifica entro la gamma dinamica di lavoro del anticorpo utilizzato. Come nota finale, la proteina intrinseca totale che entra nel test per ogni campione deve essere caricato anche nelle corsie della curva standard. Ciò è facilmente ottenibile con una proteina carrier (come fegato di ratto), che non esprime TH.

1. . ser19 Dei tre siti di fosforilazione, ser19 stechiometria i livelli di fosforilazione sono maggiori in SN e VTA, che vanno 0,15-0,25 ^2,10,11. L'altra considerazione è che il nostro metodo di rilevazione, ser19 ps è quantificato nella gamma lineare tra 0,5 e 5,0 ng fosfo-ser19 ^10. Alla luce di queste considerazioni, per un totale di carico di proteine ​​TH tra 5 e 10 ng (dando così circa 0,75-2,5 ng fosfo-ser19 dal campione) fornirebbe una misura affidabile di ser19 fosforilazione TH. Usiamo Phosphosolutions primaria (Cat. # p1580-19) a diluizione 1:1000.
2. ser31 ser31. stechiometria livelli di fosforilazione sono relativamente meno in SN e VTA rispetto alle loro regioni affini campo dei terminali, che vanno da ~ 0,04-0,10 ^2,4,10,11. Con il nostro metodo di rilevazione, ser31 ps viene rilevato nella gamma lineare tra 0,5 e 7,0 ng fosfo-ser31 ^10. Alla luce di queste considerazioni, per un totale di carico di proteine ​​TH tra 10 e 30 ng (dando così circa 0,50-3,0 ng fosfo-ser31 dal campione) fornirebbe una misura affidabile della fosforilazione ser31TH. Vedi Figura 4A per un esempio di ser31 quantificazione. Il nostro anticorpo primario è un in-house purificate per affinità anticorpo che è stato prodotto da Biochemicals ²¹ ° secolo, (Boston, MA), e convalidato per la specificità della fosfo-epitopo utilizzando i nostri in-house standard ^2.
3. ser40 ser40 livelli di fosforilazione stechiometria in SN e vanno da VTA ~ 0,02 -. 0,06 ^2,4,10,11. Con il nostro metodo di rilevazione, sER40 ps viene rilevato nella gamma lineare tra 0,2 e 2,0 ng fosfo-ser40 ^10. Alla luce di queste considerazioni, per un totale di carico di proteine ​​TH tra 10 e 30 ng (dando così uno stimato 0,20-1,8 ng fosfo-ser40 dal campione) fornirebbe una misura affidabile della fosforilazione ser40TH. Vedi 4B figura per un esempio di ser40 quantificazione. Usiamo Phosphosolutions primaria (Cat. # p1580-40) a diluizione 1:1000.

5. Risultati rappresentativi

1. La dopamina in SN vs VTA Ci sono tre letture di dopamina (o metaboliti) che possono essere presi in analisi quantitativa;. Secondo totale recuperata dalla dissezione, per le proteine, e per le proteine ​​TH (come dimostrano ad striato, SN, nucleo accumbens, e VTA in tabella 1). Il recupero della dopamina totale tra SN e VTA è abbastanza simile, compresa tra 6-9 ng per due o tre dissezioni fetta coronali ^2. Normalizzare il recupero della dopamina alle proteine ​​totali mostrerà that, basato sul metodo di dissezione impiegato, che il VTA avrà maggiore dopamina per proteine ​​totali, media di 6-8 ng / mg di proteina in SN e 9-10 ng / mg di proteina in VTA ^{2, 4.} Infine, la normalizzazione della dopamina per TH totale recuperata dovrebbe rivelare una differenza tra SN e VTA, essendo maggiore nel VTA ^10, e compresa tra 0,2 e 0,8 ng dopamina per proteina TH ng tra le due regioni ^2,10.

   DA regione	Totale DA recuperato	DA per mg di proteina	DA per ng ​​TH
   striato	214 ± 16	165 ± 13	0,56 ± 0,11
   SN	8,4 ± 0,8	6,1 ± 0,5	0,18 ± 0,03
   Nucleus accumbens	60 ± 6	75 ± 4	0,77 ± 0,03
   VTA	6,0 ± 1,0	9,2 ± 1,4	0,22 ± 0,03

2. Proteine ​​totali: TH, DAT, VMAT2 Utilizzando la calibrata standard di proteine ​​TH per la quantificazione, più TH viene recuperato in SN che il VTA dalla dissezione (60 ng in SN e 26 ng in VTA ^2). Tuttavia, quando normalizzata a proteine, questo rapporto inverte, con TH per proteine ​​totali del VTA essere ~ 3 - a 5 volte superiore rispetto al SN, (~ 0,32 ng / mg proteina in VTA e ~ 0,09 in SN) ^{4, 10.}
   L'atteso recupero DAT in SN e VTA è simile, con il recupero un po 'più nel VTA secondo proteine ​​totali o secondo TH totale recuperata ^4. In particolare, proteina DAT è molto meno abbondanti in queste regioni rispetto alle regioni cognate campo terminali ⁴ .
   VMAT2 recupero per proteine ​​totali è maggiore nella VTA rispetto SN ^4. Tuttavia, quando normalizzata per TH proteine, c'è il recupero leggermente maggiore nel SN ^4.
3. Sito-specifica fosforilazione TH Da un certo numero di studi, sono stati risultati consistenti in ser19, ser31, e ser40 quantità fosforilazione nella SN e VTA, e anche in relazione alle regioni cognate campo terminali. Ser19 fosforilazione è notevolmente maggiore nel SN e VTA (~ 0,2-0,3) rispetto al corpo striato e nel nucleo accumbens (~ 0,05-0,15) ^2,4,7,10,11. Ser31 fosforilazione è significativamente inferiore nel SN e VTA rispetto alle loro regioni affini campo terminali, essendo ~ 0,06-0,10 tra queste regioni somatodendritic ^2,4,7,10,11. Durante l'inibizione della decarbossilasi dell'acido aromatico con NSD-1015, vi è un aumento di 2 volte in ser31 fosforilazione in soli ¹⁰ VTA. Ser40 fosforilazione varia tra 0,02 e 0,05 nel SN eVTA e generalmente questo stechiometria non differisce significativamente dalle regioni affini campo terminali ^2,4,7,10,11.

Figura 1. Letture dopaminergici da una dissezione tessuto.

Figura 2. Tecnica di dissezione per isolare l'neuropilo dopaminergico mesencefalo. Tecnica per la dissezione substantia nigra (SN) dalla zona ventrale tegmentale (VTA). 1. Rimuovere corteccia sovrastante e l'ippocampo (queste strutture siano già stati rimossi nell'immagine sopra). 2. Praticare un taglio verticale che separa la zona pigmentata della SN dal VTA. 3. Effettuare un taglio orizzontale o vicino alla linea mediana appena sopra la parte più dorsale e laterale del SN. 4. Stuzzicare la SN lontano dal resto del tronco encefalico. Una volta SN è stato rimosso, analogamente stuzzicare il VTA dallaresto del mesencefalo. Nota: questa sezione si osserva tipicamente in corrispondenza delle coordinate, rispetto al bregma, di AP 5.7.

Figura 3. Seconda (e ultima) la normalizzazione del totale colorazione delle proteine ​​carico Ponceau S per l'analisi dell'immagine J. Proteine ​​Ponceau S colorazione di una determinazione TH totale in campioni di ratto substantia nigra. I primi cinque corsie formano la sinistra sono la curva standard TH totale, al quale pg di proteina 28 da omogenato di fegato di ratto è stato aggiunto a rispecchiare il carico di proteine ​​dai campioni di substantia nigra. La corsia successiva contiene peso molecolare (MW) i marcatori. Le corsie rimanenti contengono ~ 28μg di proteine ​​da campioni di ratto substantia nigra. I carichi proteici sono basati sulla concentrazione proteica di ciascun campione, determinato con il metodo BCA. Tuttavia, nonostante ciò che dovrebbe essere carichi uguali, ci sono variazioni nel buio della colorazione Ponceau S tra i campioni che indicano un leggerovariabilità in concentrazioni proteiche, che è corretta per la normalizzazione utilizzando un'analisi ImageJ per analizzare la quantità di colorazione Ponceau S per ciascun campione.

Figura 4. Rappresentativi risultati TH fosforilazione dai controlli e trattamenti. Rappresentante ser31 tirosina idrossilasi fosforilata (PTH) e ser40 blot PTH occidentali di ratti trattati con soluzione salina e metanfetamine Wistar da un precedente studio ^4. A. ser 31 PTH in campioni di ratto substantia nigra. I calibrati ser 31 gamme di PTH curva standard da 0,3 a 2,0 ng ng ed è all'interno del range lineare di rilevazione. Sulla base di precedenti analisi Western blot dei livelli di TH totali, 6 ng di TH totale sono stati caricati per ogni campione. B. ser40 PTH in campioni di ratto tegmentale ventrale. Le calibrate ser40 gamme di PTH curva standard da 0,2 a 1,5 ng ng ed è all'interno del range lineare di rilevazione. Sulla base di precedenti analisi Western blot dei livelli di TH totali, 9 ng dei TH totale sono stati caricati per ogni campione.

Discussione

Come illustrato nella figura 1, i metodi descritti sopra dovrebbe produrre letture multiple di dopamina e della sua TH proteine ​​che regolano, DAT, e VMAT2 da un campione di SN o VTA ottenuti dal ratto o topo. Anche in questo caso, i benefici di realizzare questo protocollo è che il ricercatore può ottenere letture operativamente trovati di come dopamina è regolata in vivo in virtualmente qualsiasi paradigma sperimentale e, così facendo, risparmiare notevoli risorse sperimentali riducendo il numero di animali ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo
Di sodio dodecil solfato (SDS)	- JT Baker	4095-02
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
Trizma HCl	Sigma	T3253-1KG
Glicerina	Sigma	G8773-500 mL
PVP-40	Sigma	PVP40-1KG
DPBS	Gibco	21600-069
Tween 20	Sigma	P1379-500 mL
Glycine	Sigma	G8898-1KG
Ponceau S	Fluka	81460
Blu di bromofenolo	Sigma	B8026-5G
Ditiotreitolo	Sigma	D-9163
Protein Standard 2 mg di BSA	Sigma	P5619-25VL
Pierce BCA Protein Assay Reagente A	Thermo Fisher Scientific-	23223
Più di precisione standard Protein	Bio Rad	161-0373
[125I]-proteina A, specifica attività	Perkin-Elmer

Reagenti	Formule
10% SDS	10 g SDS, 100 ml di H 2 0
1% SDS (a pH 8,2)	10 mL10% SDS 60,5 mg Trizma Base 37,22 mg EDTA 90 ml di H 2 0
Solfato di rame Solution II	1 g di solfato di rame II 25 ml di H 2 0
Sample Buffer 3X	Trizma Base 2,27 g SDS 6 g Ditiotreitolo 0,463 g 30 g di glicerina Blu di bromofenolo 10 mg DIH 2 0 (inizialmente aggiungere sopra i reagenti a 40 mL di H 2 0 in un cilindro graduato; quindi aggiungere H 2 0 fino a volume raggiunge 100 mL) HCl (aggiungere quanto necessario per raggiungere pH 6,85) Congelare la soluzione in 50 tubi di 2.0 ml. (Fa 100 mL): Volume di tampone campione 3X necessario ½ = volume di SDS nel campione utilizzato.
1X Sample Buffer	Diluire il tampone 3X campione fino a 1X tampone del campione utilizzando DI H 2 0
10X Il tampone di corsa (Fa 4 L)	Trizma Base 121,1 g Glycine 577 g SDS 40 g
Buffer 10X Transfer: (Per 4 L)	Glycine 360 ​​g Trizma base 96 g
Ponceau	Ponceau S. 0,5 g Acido acetico 5 mL DI H 2 0 95 ml
0,2% soluzione di HCl	5,2 ml di HCl in 500mL di DI H 2 0
PVP-T20 blocco Soln. (Fa 4 L)	PVP-40 40 g DPBS 38,2 g Tween 20 2 g Thimerisol 0,4 g 1M Tris pH 7,6 (60,6 g Tris HCl + 13,9 g di Tris base in 500 ml di H 2 0) - 50 mL
Buffer 10X Blot (Fa 4 L)	Tween 20 20 g Tris base 14 g Tris HCl 61 g