Articolo metodologico

Un protocollo semplice per Estrazione emociti da bruchi selvaggi

DOI:

10.3791/4173

⸱

15 novembre 2012

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, The George Washington University

In questo articolo

Sommario

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Emociti insetti svolgere molte funzioni importanti, sia immunitarie e non immunitarie, durante tutte le fasi di sviluppo degli insetti. La nostra attuale conoscenza dei tipi di hemocyte e la funzione viene da studi su insetti modelli genetici. Qui vi presentiamo un metodo per l'estrazione, la quantificazione e la visualizzazione di emociti da bruchi selvatici.

Abstract

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Emociti insetti (equivalente a mammiferi globuli bianchi) svolgono un ruolo importante in diversi processi fisiologici durante tutto il ciclo di vita di un insetto 1. Negli stadi larvali di insetti appartenenti agli ordini dei Lepidotteri (farfalle e falene) e Ditteri (mosche vere), emociti sono formate dalla ghiandola linfatica (un organo specializzato ematopoietiche) o cellule embrionali e possono essere trasportati fino alla fase adulta. Emociti embrionali sono coinvolti nella migrazione cellulare durante la regolazione dello sviluppo e chemiotassi durante l'infiammazione. Hanno anche prendere parte a apoptosi delle cellule e sono essenziali per embriogenesi 2. Emociti mediare il braccio cellulare dell'insetto risposta immunitaria innata che include diverse funzioni, come la cella di diffusione, aggregazione cellulare, formazione di noduli, la fagocitosi e l'incapsulamento di invasori stranieri 3. Essi sono anche responsabili per orchestrare specifiche difese insetto umorali durante l'infezione, come la produzione di peptidi antimicrobici e altre molecole effettrici 4, 5. Hemocyte morfologia e funzione sono principalmente stato studiato in modelli genetici insetti o fisiologico, compresa la mosca della frutta, Drosophila melanogaster 6, 7, le zanzare Aedes aegypti e Anopheles gambiae 8, 9 e il hornworm tabacco, Manduca sexta 10, 11. Tuttavia, esistono scarse informazioni attualmente circa la diversità, la classificazione, la morfologia e la funzione di emociti in non-modello di specie di insetti, in particolare quelli raccolti in natura 12.

Qui si descrive un protocollo semplice ed efficiente per l'estrazione di emociti da bruchi selvatici. Usiamo penultimo instar Lithacodes fasciola (giallo-spalle falena slug) (Figura 1) e Euclea delphinii (spinoso slug rovere) bruchi (Lepidoptera: Limacodidae) e mostrare che i volumi sufficienti di emolinfa (sangue degli insetti)può essere isolato e numeri hemocyte contati da larve individuale. Questo metodo può essere usato per studiare efficientemente tipi hemocyte in queste specie così come in altri bruchi di lepidotteri correlati raccolti dal campo, oppure può essere facilmente combinati con analisi immunologiche destinati a studiare la funzione hemocyte dopo infezione microbica o organismi parassitari 13.

Protocollo

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1. Preparazione del materiale

  1. Preparare gli aghi (1-2 micron e punta conica 3-4 mm) con tubi in vetro borosilicato capillari nonché di un estrattore micropipetta. Le impostazioni dello strumento: a terra: 561, velocità: 20; calore: 560; ritardo: 1; tiro: 100; Pressione: 500.
  2. Preparare la soluzione di raccolta: 60% del Medio Grace (GM) integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 20% di tampone di anticoagulante (98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA e 41 mM di acido citrico, pH 4,5 ). La suddetta soluzione è preparato fresco in condizioni sterili e mantenuto in ghiaccio in ogni momento.
  3. Preparare la soluzione tampone di incubazione: 90% di GM integrato con 10% di FBS. Questa soluzione è anche preparato fresco e mantenuto in ghiaccio in ogni momento.
  4. Preparare un totale di almeno 15 microlitri × il numero di insetti sia per la raccolta e le soluzioni di incubazione.

2. Iniezione di bruchi con Collection Solution

  1. Anestetizzare ins penultimelarve tar da raffreddamento in ghiaccio per 20 minuti prima dell'estrazione hemocyte.
  2. Montare la punta di un ago capillare (calibro 16) nel tubo che è collegato ad una siringa da 20 ml di vetro (Figura 2). Lasciare il tubo contenente la soluzione di raccolta aperto sul banco di laboratorio e riempire lentamente il capillare con il buffer. Il capillare è generalmente riempito con circa 10-15 ml di soluzione di raccolta, a seconda delle dimensioni del bruco (circa 1 ul di soluzione per 10 mg di massa corporea caterpillar totale = 0,01% della massa totale del corpo). Appoggiare l'ago su una palla di argilla che si trova accanto al microscopio da dissezione.
  3. Posizionare il bruco in una capsula di Petri. L'insetto deve essere posizionato su un lato in modo che gli spiracoli sono chiaramente visibili (Figura 3).
  4. Durante la visualizzazione sotto un microscopio da dissezione, tenere il bruco in posizione con una pinza e posizionare il ago vicino ad una delle spiracoli, in cui lacuticola setta è generalmente più dolce. Premere delicatamente l'ago capillare contro il corpo dell'insetto. Una volta che l'ago è penetrato nella cuticola, iniettare il volume totale della soluzione nel bruco (Figura 3). E 'importante evitare l'iniezione di bolle d'aria nel bruco. Il corpo del bruco si gonfiano (ad esempio, aumento del volume del 20%) in seguito a iniezione, ma non dovrebbe scoppiare o trasudano.
  5. Tornare il bruco al ghiaccio, posizionando l'insetto dorsalmente per impedire tampone di fuoriuscire dalla ferita (Figura 3).
  6. Ripetere i passaggi 2,1-2,4 per ogni caterpillar usato per l'estrazione emolinfa. In questa fase, tutti gli insetti consentono di raffreddare in ghiaccio per 30 minuti prima di procedere.

3. Estrazione di emociti

  1. Posizionare il bruco in una capsula Petri sotto il microscopio da dissezione.
  2. Fai un poco profondo (2-3 mm di lunghezza) incisione nella regione posteriore del bruco con un Scalpe sterile l (Figura 3). Fare attenzione a non danneggiare l'intestino o di altri organi interni, l'obiettivo è quello di perforare la cuticola con attenzione e raccogliere il buffer / emolinfa mix contenente emociti dagli insetti individuali.
  3. Premere il bruco delicatamente con pinze flessibili in plastica, mentre la raccolta del mix emolinfa (circa il 10-20 pl), con una punta di 10 microlitri pipetta, ancora una volta facendo attenzione a non danneggiare i tessuti interni (Figura 3). Emolinfa è raccolto dalla gocciolina spremuto dal corpo del bruco. Eliminare il caterpillar i resti.
  4. Raccogliere emolinfa da ogni singolo bruco in distinte provette etichettate siliconato 0,5 ml microcentrifuga.
  5. Aggiungere uguale volume della soluzione di incubazione (circa 10-20 microlitri) di ciascun campione emolinfa raccolti da un individuo bruco. Tenere campioni emolinfa su ghiaccio in ogni momento.
  6. Ripetere i passaggi 3,1-3,5 per ogni caterpillar utilizzato per l'esperimento.
Le "> 4. Quantificazione di emociti

  1. Mescolare il campione e la soluzione emolinfa incubazione immediatamente prima emociti conteggio. Questo trattamento consente un'adeguata separazione delle emociti e previene formazione di grumi.
  2. Utilizzare una pipetta pulita per trasferire 10 microlitri di campione emolinfa miscelata con la soluzione di incubazione su un emocitometro.
  3. Utilizzando un microscopio composto, contare e registrare il numero di emociti in almeno 15 dei quadrati grandi (area del quadrato uno: 0,04 mm 2, profondità: 0,1 mm) della griglia centrale del emocitometro (Figura 3). Aggiungere questi valori per ottenere una somma totale del numero di emociti nei 15 quadrati.
  4. Sciacquare il emocitometro e la sua slitta coperchio a fondo utilizzando una bottiglia di lavaggio con acqua distillata e deionizzata e asciugare con Kimwipes (Kimberly-Clark) tra ogni campione.
  5. Ripetere i passaggi 4,1-4,4 per ogni campione emolinfa.
  6. Calcolare il numero medio di emociti per ml di emolinfa volume per ogni caterpillar, come segue:

Il volume totale di ciascun quadrato della griglia emocitometro: (0,04 mm 2 zona) × (0,1 mm di profondità) = 0,004 mm 3 × 15 caselle = 0,06 mm 3 = il volume totale di tutti i 15 quadrati contati.

(Somma del numero totale di emociti nei 15 quadrati contati / il volume totale di tutti i 15 quadrati contati) x 2 = fattore di diluizione del numero di emociti / mm 3 x 1.000 = il numero di emociti / ml di emolinfa.

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Risultati

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Il protocollo qui descritto consente la raccolta di un volume minimo di 10-20 ml di emolinfa insetto da bruchi individuali. Emociti raccolti con questo metodo sono privi di aggregazione cellulare, difetti melanizzazione, frammenti di tessuto o altri contaminanti. Pertanto emociti possono essere facilmente osservati e contati al microscopio, e diversi insetti può essere osservato in un Hosur pochi. Abbiamo osservato che la maggior parte dei emociti nei nostri campioni erano plasmatocytes 3 ​​(emociti diffusion...

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Discussione

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Metodi per l'estrazione di emociti da insetti clinicamente importanti lepidotteri e insetti modello sono stati precedentemente segnalati 9, 14. Metodi di estrazione Hemocyte sono adattati a seconda delle specie di insetti, lo stadio di sviluppo dell'insetto e le sue caratteristiche morfologiche. Per esempio, l'isolamento emolinfa da larve Manduca può essere facilmente eseguita tagliandoli corno curvo vicino all'estremità dell'addome 15. Perché bruchi slug (Limacodidae) ...

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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TMS è stato sostenuto dalla fiducia Harlan Fellowship (GWU) nel corso di questo studio. I finanziamenti per la raccolta sul campo e allevamento L. Fasciola e E. delphinii sono state fornite dal NSF concedere DEB 0642438 al JTL.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagente Azienda Numero di catalogo Commenti
Micropipetta estrattore Sutter Instruments P-1000
Tubi di vetro borosilicato Sutter Instruments B100-50-10 OD: 1.0, ID: 0.50 mm
Media di Grace Sigma G8142
Siero fetale bovino Thermo Fisher Scientific SH3007102 Inattivato al calore
Dumont # 5 Pinze Strumenti per le scienze Belle 11252-40
Neubauer emocitometro Hausser scientifico 3200
Tubi di plasticang Tri-Tech TT-3-32OD OD: 3/32'', ID: 1/32 '
Vetro medico siringa Fortuna Optima D-97.877 50 ml di volume
'Ago Blunt Piccole parti NE-162PL-25 Calibro 16 x 1 "lunghezza

Riferimenti

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