Articolo metodologico

LabVIEW a comando nanolitri osmometro Novel per le indagini Protein Ice rilegatura

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DOI:

10.3791/4189

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4 febbraio 2013

 , 
1Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition , The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food, and Environment, The Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Physics and Astronomy, Ohio University

In questo articolo

Sommario

Proteine ​​leganti ghiaccio (IBPs), noto anche come proteine ​​antigelo, inibiscono la crescita di ghiaccio e sono un additivo promettente per l'uso nella crioconservazione dei tessuti. Lo strumento principale utilizzato per indagare IBPs è il osmometro nanolitri. Abbiamo sviluppato una casa progettata fase di raffreddamento montato su un microscopio ottico e controllato utilizzando un custom-built routine di LabVIEW. Il osmometro nanolitri qui descritto manipolato la temperatura del campione in un ultra-minuscole.

Abstract

Le proteine leganti il ghiaccio (IBP), tra cui le proteine antifreddo, le proteine di strutturazione del ghiaccio, le proteine di isteresi termica e le proteine inibitrici della ricristallizzazione del ghiaccio, si trovano in organismi adattati al freddo e li proteggono dai danni da congelamento interagendo con i cristalli di ghiaccio. Le IBP sono presenti in una varietà di organismi, tra cui pesci1, piante2, 3, artropodi4, 5, funghi6 e batteri7. Le IBP si adsorbono sulle superfici dei cristalli di ghiaccio e impediscono alle molecole d'acqua di unirsi al reticolo di ghiaccio nel punto di adsorbimento delle IBP. Il ghiaccio che cresce sulla superficie del cristallo tra le IBP adsorbite sviluppa un'elevata curvatura, che abbassa la temperatura alla quale i cristalli di ghiaccio crescono, un fenomeno noto come effetto Gibbs-Thomson. Questa depressione crea un intervallo (isteresi termica, TH) tra il punto di fusione e il punto di congelamento in condizioni di non equilibrio, entro il quale la crescita del ghiaccio viene arrestata8-10, vedi Figura 1. Uno degli strumenti principali utilizzati nella ricerca sulle IBP è l'osmometro nanolitro, che consente di misurare l'attività di TH delle soluzioni di IBP. Gli osmometri nanolitro, come lo strumento Clifton (Clifton Technical Physics, Hartford, NY) e lo strumento Otago (Otago Osmometers, Dunedin, Nuova Zelanda), sono stati progettati per misurare l'osmolarità di una soluzione misurando la depressione del punto di fusione di gocce con volumi nell'ordine del nanolitro. Questi dispositivi sono stati utilizzati per misurare le osmolarità di campioni biologici, come le lacrime11, e si sono rivelati utili nella ricerca sulle IBP. Il controllo manuale di questi osmometri nanolitro limitava le possibilità sperimentali. Le variazioni di velocità della temperatura non potevano essere controllate in modo affidabile, il range di temperatura dello strumento Clifton era limitato a 4.000 mOsmol (circa -7,5 °C) e la registrazione della temperatura in funzione del tempo non era un'opzione disponibile per questi strumenti.

Abbiamo progettato un sistema personalizzato di osmometria a livello nanolitro controllato da computer, utilizzando una piattaforma LabVIEW (National Instruments). Il palchetto refrigerante, descritto in precedenza9, 10, contiene un blocco metallico attraverso cui circola acqua, funzionando così da dissipatore di calore, vedere Figura 2. A questo blocco sono collegati raffreddatori termoelettrici che possono essere azionati mediante un regolatore di temperatura commerciale controllabile tramite moduli LabVIEW, vedere Figura 3. Ulteriori dettagli sono forniti più avanti. Il principale vantaggio di questo sistema è il controllo termico altamente sensibile, vedere Figura 4. Il controllo automatizzato della temperatura permette la sincronizzazione di una rampa termica fissa con un'uscita di microscopia video contenente ulteriori dettagli sperimentali.

Per studiare la dipendenza temporale dell'attività di TH, abbiamo testato una IBP iperattiva di 58 kDa proveniente dal batterio antartico Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. Questa proteina era stata marcata con proteine fluorescenti verdi migliorate (eGFP) in un costrutto sviluppato dal gruppo di Peter Davies (Queens University)10. Abbiamo dimostrato che il profilo di variazione della temperatura influenzava l'attività di TH. Un eccellente controllo del profilo termico in questi esperimenti ha migliorato significativamente le misurazioni di TH. L'osmometro nanolitro ci ha inoltre permesso di verificare l'inibizione della ricristallizzazione da parte delle IBP5, 13. In generale, la ricristallizzazione è un fenomeno in cui i cristalli più grandi crescono a spese di quelli più piccoli. Le IBP inibiscono efficacemente la ricristallizzazione, anche a basse concentrazioni14, 15. Abbiamo utilizzato il nostro osmometro controllato da LabVIEW per seguire quantitativamente la ricristallizzazione del ghiaccio e mantenere costante la frazione di ghiaccio mediante un'analisi video in tempo reale simultanea delle immagini e un controllo termico in retroazione dalla camera del campione13. I calcoli in tempo reale offrono ulteriori opzioni di controllo durante la procedura sperimentale. È stata sviluppata una piastra per microscopio invertito per ospitare dispositivi microfluidici a controllo termico, che sarà descritta altrove16.

Il sistema di piastra fredda

L'insieme del palchetto refrigerato (Figura 2) è costituito da un set di dispositivi termoelettrici di raffreddamento che raffreddano una piastra di rame. Il calore viene dissipato dal palchetto facendo circolare acqua fredda attraverso un compartimento chiuso posto al di sotto dei dispositivi termoelettrici. Un foro di 4 mm di diametro al centro della piastra di rame funge da finestra di osservazione. È stato praticato un foro planare di 1 mm di diametro per alloggiare il termistore. Un disco di rame su misura (7 mm di diametro) con diversi fori (500 μm di diametro) è stato posizionato sulla piastra di rame e allineato con la finestra di osservazione. Dell'aria è stata pompata a una portata di 35 ml/sec e asciugata utilizzando Drierite (W.A. Hammond). L'aria secca è stata utilizzata per garantire un ambiente asciutto sul palchetto di raffreddamento. Il palchetto è stato collegato, tramite un connettore a 9 pin, a un regolatore di temperatura (Modello 3040 o 3150, Newport Corporation, Irvine, California, Stati Uniti). Il regolatore di temperatura è stato collegato tramite un cavo a una scheda GPIB-PCI per computer (National Instruments, Austin, Texas, Stati Uniti).

Protocollo

0. Procedure preliminari

  1. Capillare di vetro per l'iniezione soluzione. Utilizzando un estrattore capillare (Narishige, Tokyo, Giappone), preparare una pipetta con una forte apertura multa da un tubo capillare di vetro micro (Marca GMBH, Wertheim, Germania). La dimensione dell'apertura deve essere verificata facendo passare aria attraverso il capillare per ottenere bubbling bene in acqua pulita. Se il capillare è chiuso, si può aprirlo rompendo il bordo. Ciò può essere realizzato per stampaggio o graffiare delicatamente contro l'acqua contenente pareti del tubo. Preparare il capillare tale che l'apertura è quasi bloccata, ma sufficientemente aperta per consentire la formazione di bolle sub-millimetri.
  2. Pulizia del disco di rame. Sonicare i dischi di rame per 10 min a 0,1% Micro-90 sapone (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, Stati Uniti d'America), poi lavare con acqua bidistillata. Introdurre i dischi in un (tecnico) soluzione di isopropanolo e sonicare ancora per 10 min. Pinnaalleato, asciugare i dischi con aria filtrata. Questa fase di pulizia è fondamentale per evitare la contaminazione tra esperimenti IBP.
  3. Doppio strato di montaggio coprioggetti. Gruppo coprioggetti è stato preparato per consentire l'osservazione del campione senza condensa di umidità sulla superficie del vetro di copertura. Questo è stato ottenuto inserendo una (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, USA) Drierite particelle (2 mm di diametro) tra due vetrini che poi sono stati incollati con una pistola per colla a caldo. Questa configurazione impedisce condensa che potrebbe bloccare la vista quando il campione è stato raffreddato a basse temperature e rimosso la necessità di soffiare aria secca sulla finestra di osservazione.

1. Fase di raffreddamento Set-up

  1. Collegare l'ingresso del flusso d'acqua e di uscita della fase di raffreddamento a 4 mm di diametro interno tubi Tygon (Saint-Gobain, Parigi, Francia), e collegare il tubo di flusso dell'acqua in ingresso ad una pompa dell'acqua.
  2. Collegare un tubo interno 4 mm di diametro Tygon all'ingresso del t stadio di raffreddamentoo fornire aria secca. L'aria è stata essiccata con un in-linea di colonna Drierite.
  3. Far funzionare le pompe di aria e acqua. Si noti che gli elementi di raffreddamento non dovrebbe essere eseguito senza un dissipatore di calore.
  4. Accendere il regolatore di temperatura, macchina fotografica, e di routine LabVIEW.

2. Preparazione del campione

  1. Posizionare una gocciolina 3-4 pl di olio B immersione (Cargille laboratori, Cedar Grove, New Jersey, USA) sul lato posteriore di un disco diametro 7 mm rame avente fori 500 micron perforati attraverso il disco.
  2. Posizionare il disco di rame sulla fase di raffreddamento con il lato rivolto verso il basso immersione in olio.
  3. Collegare il tubo capillare (il bordo smussato) ad un tubo di diametro interno 0,7 millimetri Tygon collegata all'altra estremità ad una siringa 2 ml di vetro (Poulten-Graf, Wertheim, Germania).
  4. Prima di utilizzare il tubo capillare, controllare la piccola apertura del capillare per garantire che l'apertura è una dimensione appropriata (vedere le procedure preliminari).
  5. Inserire lentamente il GLAss capillare nella provetta preparato proteina IBP (2,4 pM Mp IBP-GFP in 20 mM CaCl 2 e 25 mM Tris-HCl a pH 8, vedi riferimento 10 per i dettagli di preparazione) e tirare la siringa di vetro fino a quando il capillare di vetro contiene 0,1 pl della soluzione proteica.
  6. Iniziare la registrazione video tramite il software LabVIEW.
  7. Inserire il bordo tagliente del capillare di vetro (contenente la soluzione di proteina) in uno dei fori del disco di rame in fase di raffreddamento.
  8. Osservando al microscopio (Olympus, Tokyo, Giappone, obiettivo 10x), con attenzione penetrare lo strato di olio di immersione con la punta capillare di vetro, e premere la siringa di vetro (molto delicatamente) per fornire una piccola quantità (~ 10 nl) della proteina soluzione per creare un droplet 200 micron.
  9. Coprire il foro nella fase di raffreddamento con il gruppo a doppio strato coprioggetto (consultare le procedure preliminari).

3. TH attività di misura

  1. Press il pulsante di raffreddamento e la temperatura a -40 ° C.
  2. Inizialmente, la goccia soluzione sarà limpida. A basse temperature, tipicamente nel campo da -30 ° C a -35 ° C, il colore gocciolina cambia, indicando che la soluzione è stata congelata. Immediatamente dopo che il campione è congelato, aumentare la temperatura lentamente finché il ghiaccio bulk inizia a fondere. Un graduale aumento della temperatura è necessaria per evitare il superamento della temperatura che potrebbe portare alla completa fusione del campione.
  3. Passare a un obiettivo 50x e cominciare a sciogliere il ghiaccio con regolazione della temperatura. Questa regolazione è interattivo, e le fasi finali sono in genere eseguita con passi piccoli temperatura di 0,002 ° C. Continuare a fondere fino a quando rimane un singolo cristallo. La dimensione finale del cristallo deve essere di circa 10 micron. La massima temperatura alla quale ha cessato di fusione è determinato essere il punto di fusione ed è determinata con precisione nella fase successiva analisi video.
  4. Impostare la temperatura di pochi centesimi di un grado Celsius sotto del punto di fusione del cristallo e iniziare una rampa di temperatura con un ritardo di 10 min. Regolare la velocità di rampa come desiderato. Durante questo tempo, il cristallo viene esposto ai IBPs.
  5. Al termine del tempo di 10 minuti di esposizione, la temperatura diminuisce automaticamente sotto il controllo della routine LabVIEW.
  6. Osservare la forma di cristallo al diminuire della temperatura. Ad un certo punto, l'improvviso scoppio del cristallo di ghiaccio può essere osservato. La temperatura alla quale si verifica ciò è notato come la temperatura scoppio cristallo.
  7. Utilizzare video analisi per determinare il punto preciso fusione e la temperatura di scoppio. In primo luogo, con l'analisi video, trovare il punto esatto di fusione. Ricordiamo che la temperatura massima alla quale ha cessato di fusione è determinato essere il punto di fusione. Documentare questo punto di fusione in un programma di foglio di calcolo. Quindi, determinare la precisa temperatura scoppio cristallo, e documentare questo valorepure. La differenza tra il punto di fusione e il punto di congelamento, o temperatura scoppio cristallo, è l'attività isteresi termica della soluzione IBP.

4. Misura della funzione del tempo di attività TH

  1. Seguire il protocollo descritto nelle sezioni 3,1-3,3 per preparare un singolo cristallo di ghiaccio.
  2. Dopo la formazione del cristallo, impostare il tempo di ritardo della rampa nel modo desiderato, e accendere la rampa.
  3. La temperatura diminuirà ad un tasso fisso (a seconda delle esigenze degli operatori) automaticamente una volta che il tempo di ritardo rampa è passato.
  4. Documentare la temperatura alla quale si verifica la rottura di cristallo. Calcolare il tempo di esposizione (tempo tra la formazione di cristalli e lo scoppio cristallo).
  5. Ripetere l'esperimento per diversi tempi di ritardo e tracciare l'attività TH come funzione del tempo di esposizione per valutare la dipendenza dal tempo dell'attività TH.

Risultati

Misurazione della dipendenza dal tempo TH

Il LabVIEW azionati osmometro nanolitri facilita l'esecuzione di misure accurate attività TH. La costante di velocità di riduzione della temperatura consentita la misurazione della dipendenza dal tempo TH. Il controllo preciso della temperatura abilitato dal osmometro nanolitri era cruciale per questi esperimenti. Il tempo di esposizione di un cristallo di ghiaccio ai IBPs in soluzione è definita come il periodo di tempo dalla formazione del cristallo (la fine del processo di fusione), finché la crescita improvvisa di ghiaccio intorno al cristallo (burst cristallo). Abbiamo trovato che il tempo di esposizione dei cristalli di ghiaccio ai IBPs dipende moltissimo l'attività TH. Brevi periodi di esposizione IBP (alcuni secondi) prodotto una bassa attività TH nell'IBP-GFP soluzione Mp (2,4 pM) (Figura 5). L'attività TH aumentato con il tempo di esposizione IBP fino a raggiungere un plateau a esposizione min 4 IBP. A concentrazioni più elevate IBP, la piastraau è stato raggiunto in tempi più brevi.

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Figura 1. IBPs diagramma schematico che illustra adsorbito al ghiaccio. Adottato con il permesso di 10.

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Figura 2. La fase di raffreddamento. A) collegate a tubazioni sul microscopio. B) Senza la guida superiore. C) Schema di principio.

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Figura 3. Schermata di interfaccia LabVIEW. Click qui per ingrandire la figura.

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Figura 4. Stabilità grafico della temperatura. Il regolatore di temperatura è stato impostato per abbassare la temperatura di 0,01 ° C ogni 15 sec.

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Figura 5. Mp attività TH IBP in funzione del tempo di esposizione ai cristalli di ghiaccio IBPs. Ogni punto rappresenta la media di tempo di 3-6 esperimenti.

Discussione

Questo lavoro illustra il funzionamento di un computer controllato osmometro nanolitri che permette misure accurate di attività TH con controllo della temperatura straordinario. In qualsiasi sistema sensibile alla temperatura, gradienti di temperatura desiderati devono essere evitati. Per evitare gradienti di temperatura nell'apparato qui presentato, la gocciolina di soluzione campione deve essere posizionato al centro di un foro nella fase di raffreddamento in rame disco (punto 2.7). Inoltre, il singolo cristallo dovrebbe essere al centro della goccia piuttosto che vicino ai bordi (nella maggior parte dei casi, ciò avverrà spontaneamente). La dipendenza dal tempo descritto indica che la velocità di raffreddamento può influenzare le letture TH. Pertanto, si suggerisce una relazione tra il tempo durante il quale il cristallo è stato esposto alla soluzione prima di raffreddamento, così come la velocità di raffreddamento. Abbiamo tipicamente aspettato 10 min prima rampa di discesa della temperatura a 0,01 ° C passaggi ogni 4 sec.

I LabVIEW controllati cofase oling stato adattato per l'uso con un microscopio invertito su cui dispositivi microfluidici potrebbe essere termicamente manipolato. Tale sistema facilita l'esecuzione di esperimenti di cambio soluzione con cristalli di ghiaccio e IBPs con etichetta eGFP 9, 10, 16. Il LabVIEW sistema controllato può essere adattata ad una fase Clifton collegando il regolatore di temperatura 3040 tramite un circuito di adattamento designato elettrico. Tale sistema viene utilizzato in laboratorio Davies 17. Il software LabVIEW e il designato disegno adegua circuito elettrico per la fase di Clifton sono disponibili su richiesta.

In conclusione, si descrive un osmometro nanolitri che facilita il controllo sensibile e la manipolazione della temperatura e il tasso di aumento e diminuzione della temperatura (con 0,002 ° C sensibilità), coordinati con un'interfaccia video attraverso una routine LabVIEW per analisi in tempo reale. Questo sistema può eseguire riproducibili tasso di esperimenti controllati che sono important per lo studio della cinetica delle interazioni IBP con ghiaccio. Tali esperimenti possono affrontare diverse a lungo dibattute questioni riguardanti il ​​meccanismo d'azione di IBPs.

Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta dalla ISF, NSF, e ERC. Vorremmo riconoscere aiuto tecnico con la fase di temperatura da Randy Milford, Michael Koren, Doug Shafer, e Jeremy Dennison. Assistenza allo sviluppo del software è stato fornito da o Chen, Di Xu, Rajesh Sannareddy e Sumit Bhattachary. Vorremmo ringraziare i nostri collaboratori il Prof. Peter L. Davies e il dottor Laurie A. Graham per la proteina Mp IBP e utili discussioni. Ringraziamo anche i membri del laboratorio Dr. Maya Bar-Dolev, Yangzhong Qin, il dottor Yeliz Celik, il dottor Natalya Pertaya, Ortal Mizrahy, e Guy Shlomit per il loro feedback degli utenti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome Azienda Numero di catalogo / modello Commenti
Olio di immersione di tipo B Cargille Laboratories 16484
Drierite WA Hammond Drierite 043063 2270g
Micro 90 soluzione di pulizia Cole-Parmer EW-18100-11
Capillare estrattore Narishige PB-7
Tubi di vetro capillari Marca GnbH 7493 21 75 mm, diametro 1,15
Temperaturacontrollore Newport, Irvine, California, Stati Uniti Modello 3040 Modello 3040
Microscopio ottico Olimpo Modello BH2
Obiettivo 10x Olimpo S Piano 10, 0.3, 160/0.17
Obiettivo 50x Nikon CF piano, 50X/0.55 EPI ELWD
CCD Provideo CVC-140
Tygon tubi Saint-Gobain, Parigi, Francia Tygon Formulazione S-50-HL Tubazione
Siringa di vetro (2 ml) Poulten-Graf, Wertheim, Germania 7 10227
GPIB-scheda PCI National Instruments, Austin, Texas, USA 778032-01
Video telaio grabBER IMAQ-PCI-1407 National Instruments, Austin, Texas, USA 322156B-01
LabVIEW di sistema Software Design National Instruments, Austin, Texas, USA Versione 8
DivX Author software DiVx LLC, San Diego, CA, USA

Riferimenti

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