Per purificare zigoti di S. cerevisiae, Cellule aploidi di tipo opposto accoppiamento sono stati progettati per esprimere proteine fluorescenti rossi o verdi, co-incubate per permettere la formazione dello zigote, e frazionati con un protocollo basato citometria a flusso. Il altamente arricchito frazione consente la successiva "-omiche" studi, il recupero della progenie iniziale, e la ricerca sistematica della morfogenesi zigote.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Flusso Cytometry basata Purificazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Zigoti sono intermedi essenziali tra aploidi e diploidi stati del ciclo di vita di molti organismi, tra cui il lievito (Figura 1) 1. S. Saccharomyces zigoti risultato dalla fusione di cellule aploidi di tipo accoppiamento distinte (Mata, MATalpha) e danno luogo a corrispondenti diploidi stabili che successivamente generano ben il 20 progenie diploide a causa delle loro divisioni mitotiche sorprendentemente asimmetrica 2. Formazione dello zigote è orchestrato da una complessa sequenza di eventi: In questo processo, fattori solubili accoppiamento legano a recettori cognate, innescando cascate di segnalazione recettoriali che facilitano interruzione del ciclo cellulare e culminano fusione cellula-cellula. Zigoti può essere considerato un modello per la funzione delle cellule progenitrici o staminali.
Anche se molto si è imparato a conoscere la formazione di zigoti e sebbene zigoti sono stati utilizzati per studiare cellule molecolari questioni di interesse generale signiicance, quasi tutti gli studi hanno fatto uso di miscele di accoppiamento in cui sono mescolati con una popolazione zigoti maggioranza di cellule aploidi 3-8. Molti aspetti della biochimica della formazione dello zigote e la vita continua dello zigote restano pertanto non indagato.
Rapporti di purificazione di zigoti lievito descrivere i protocolli base alle loro proprietà di sedimentazione 9, tuttavia, questa procedura sedimentazione basata non cede quasi il 90% di purezza nelle nostre mani. Inoltre, ha lo svantaggio che le cellule sono esposte a sorbitolo ipertonica. Abbiamo quindi messo a punto un procedimento di purificazione versatile. A questo scopo, coppie di cellule aploidi esprimono proteine fluorescenti verdi o rossi sono stati co-incubate per permettere la formazione zigote, raccolte in tempi diversi, e gli zigoti risultanti sono stati purificati utilizzando un protocollo basato citometria di flusso ordinamento. Questa tecnica fornisce una valutazione conveniente visiva di purezza e di maturazione. La purezza mediadella frazione è circa il 90%. Secondo i tempi di raccolta, zigoti diversi gradi di maturità possono essere recuperati. I campioni purificati forniscono un comodo punto di partenza per "-omiche" studi, per il recupero della progenie iniziale, e per lo studio sistematico di questa cellula progenitrice.
Protocollo
1. La crescita delle cellule aploidi
- Grow S. cellule di Saccharomyces dallo sfondo S288C (BY4741) in condizioni standard 10.
- Trasforma aploidi per esprimere uno dei due marcatori fluorescenti cospicui 10. I marcatori di scelta sono GFP solubili espressa nel citoplasma (pEG220, URA3/YIp, linearizzato con BglII 11) e una singola proteina ribosomale, RPL25, fuso con mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, da A. Johnston). Ci aspettiamo che le equivalenti a due colori protocolli di purificazione potrebbe fare uso di altre proteine fluorescenti brillanti che vengono sintetizzati dalle cellule aploidi parentali.....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La disponibilità di zigoti purificati dovrebbe facilitare gli studi biochimici tra cui trascrittomica, proteomica e lipidomica, nonché di indagine dei meccanismi attraverso i quali si sottopongono zigoti ciclo cellulare rientro, rimodellamento della parete cellulare, caratteristiche in erba e l'ereditarietà, ecc In alternativa, zigoti possono essere generati a partire con ceppi caratteristici portatori di mutazioni in uno o entrambi i genitori. Inoltre, gli zigoti purificati, come per cellule aploidi o diploide, pos.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott. R. Michael Sramkoski per un aiuto con citometria a flusso, il dottor Purnima Jaiswal e il Dr. Di Wu per prima input e Ilya Aylyarov per un aiuto con le illustrazioni. Supportato da NIH Grant R01GM089872 e la Citometria e Microscopia strumento Imaging Core del Comprehensive Cancer Center, causa (P30 CA43703).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente / attrezzature | Fonte | Numero di catalogo | |
| pEG220, URA3/YIp, codifica GFP citoplasmatica 11) | E. Grote | ||
| pAJ1661, URA3/CEN, codifica RPL25 fuso mCherry | A. Johnston | ||
| Fisher FB120 sonicatore | Fisher Scientific | ||
| Tubo in polipropilene con tappo filtro | BD Falcon | Rif. 352235 | |
| Microcentrifuga refrigerata | Tomy | MRX-150 | |
| Citometria di flusso soluzione guaina | Biosure | 1027 | |
| iCyt Riflessione Modello citometro a flusso | Sony | ||
| DeltaVision deconvoluzione microscopio | Applied Precision | ||
| Montante microscopio a epifluorescenza | Leica | ||
| Ultrapura agarosio | Invitrogen | 15510-07 | |
| CSM glucosio formulazione Note: Per le piastre di agar, è sufficiente includere il 2% agar (Difco) | 10 |
Riferimenti
- Herskowitz, I., Oshima, Y. Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).
- Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
