Method Article

Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo

DOI:

10.3791/4208

October 1st, 2012

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il trapianto di midollo osseo fornisce un modo per modificare il genotipo delle cellule del midollo osseo derivate. Se il gene di interesse viene espresso in cellule di midollo osseo sia derivati ​​e non le cellule del midollo osseo derivate, trapianto di midollo osseo può modificare le cellule del midollo osseo derivate da un genotipo diverso senza cambiare la non-genotipo delle cellule del midollo osseo derivate.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per capire il ruolo di un gene nello sviluppo della colite, abbiamo confrontato le risposte dei topi wild-type e geni di interessi topi knockout carenti da colite. Se il gene d'interesse è espressa in cellule di midollo osseo derivate entrambe e non le cellule del midollo osseo derivate dell'ospite, tuttavia, è possibile differenziare il ruolo di un gene di interesse in cellule derivate dal midollo osseo e non midollo osseo cellule derivate da tecnica di trapianto di midollo osseo. Per modificare il midollo osseo derivate genotipo cellule dei topi, il midollo osseo originale di topi riceventi sono stati distrutti mediante irradiazione e poi sostituito da midollo osseo del donatore di nuovo genotipo diverso. Quando wild-type topi donatore di midollo osseo è stato trapiantato in topi knockout, potremmo generare topi wild-type con l'espressione del gene in cellule derivate dal midollo osseo. In alternativa, quando i topi knockout donatore di midollo osseo è stato trapiantato in topi wild-type destinatario, topi wild-type, senza gene d'interesse che esprimeda cellule di midollo osseo derivate sono state prodotte. Tuttavia, il trapianto di midollo osseo non può essere completa al 100%. Pertanto, abbiamo utilizzato cluster di differenziazione (CD) molecole (CD45.1 e CD45.2) come marcatori di cellule del donatore e del ricevente per monitorare la proporzione di cellule del midollo osseo del donatore ottenuti in topi riceventi e il successo del trapianto di midollo osseo. Topi wild-type con CD45.1 topi knockout con genotipo e CD45.2 genotipo sono stati utilizzati. Dopo irradiazione di topi riceventi, le cellule ossee donatore di midollo di diversi genotipi sono stati infusi nei topi riceventi. Quando il midollo osseo nuovo rigenerato di prendere in consegna la sua immunità, i topi sono stati sfidati da agenti chimici (destrano solfato di sodio, 5% di DSS) per indurre colite. Qui abbiamo anche mostrato il metodo per indurre colite in topi e valutare il ruolo del gene di interesse espresso da cellule di midollo osseo derivate. Se il gene d'interesse dalle cellule ossee derivate svolge un ruolo importante nello sviluppo della malattia (come Escherichiatis), il fenotipo dei topi riceventi con trapianto di midollo osseo può essere significativamente modificati. Alla fine della sperimentazione colite, il midollo osseo derivate cellule nel sangue e midollo osseo sono state marcate con anticorpi contro CD45.1 e CD45.2 e il loro rapporto quantitativo di esistenza potrebbe essere utilizzato per valutare il successo del trapianto di midollo osseo mediante citometria a flusso. Riuscito trapianto di midollo osseo dovrebbe mostrare una vasta maggioranza di genotipo dei donatori (in termini di marcatori molecola CD) nel genotipo destinatario sia nel midollo osseo e nel sangue di topi riceventi.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Prima-voi-iniziare Considerazioni tecniche

  1. Si consiglia di utilizzare entrambi i C57/BL6 topi wild-type e topi knockout per l'esperimento perché i topi con le molecole CD corrispondenti si possono acquistare dai fornitori principali del mouse.
  2. Poiché è difficile tenere traccia dei topi wild-type e topi knockout derivate cellule del donatore dopo il trapianto di midollo osseo, è necessario utilizzare CD45.1 topi per rappresentare topi wild-type. (CD45.1 C57/SJL topi WT magazzino Jackson Laboratories # 002014).
  3. La maggior parte delle colonie del mouse sono CD45.2. I nostri topi knockout appartengono CD45.2 genotipo (in alternativa ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se il gene d'interesse gioca un ruolo significativo in cellule immunitarie durante lo sviluppo della colite, i topi che hanno ricevuto midollo osseo di genotipo diverso attraverso il trapianto di midollo osseo (WT per KO o KO per WT) dovrebbe avere un'alterata risposta alla colite DSS. Uno dei parametri più importanti per determinare la gravità della colite è la H & E colorazione dei tessuti del colon. Colon cambiamenti della struttura dei tessuti e dei segni di infiammazione può essere quantitativamente valutati da.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo approccio di midollo osseo trapianto è adatto per la ricerca di immunologia colite, infezioni, cancro, obesità e altre malattie. Questo esperimento midollo osseo trapianto è necessaria quando il gene d'interesse è espresso in entrambi derivate dal midollo osseo e non le cellule del midollo osseo derivate e il gene d'interesse si sospetta di mediare malattia da parte delle cellule da entrambe le popolazioni. Per esempio, peptide antimicrobico cathelicidin viene mostrato per modulare colite acuta. Ma è espr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato finanziato da pilota e Borsa di studio di fattibilità da UCLA-CURE Center, il morbo di Crohn e Colite Foundation of Career Development Award America (# 2691) e Istituto Superiore di Sanità NIDDK K01 (DK084256) finanziamenti per Hon Wai Koon.

Midollo osseo irradiazione operazione è stata assistita da Bernard Levin e cucina Scott di UCLA Center for Research mouse AIDS / umano Core Facility Chimera. Citometria di flusso operazione è stata assistita da impianto UCLA Nucleo Vector.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nome del reagente Azienda Numero di catalogo
Cella colorazione tampone Biolegend # 420201
10X tampone di lisi RBC Biolegend # 420301
FITC isotipo di controllo del mouse Biolegend # 400207
PE del mouse isotipo di controllo Biolegend # 400211
PE anti-topo CD45.2 Biolegend # 109807
FITC anti-topo CD45.1 Biolegend # 110705
Anti-mouse CD16/32 blocco Biolegend # 101301
40 filtro cella pm FISHERBRAND # 22363547
PBS 1X MP Biomedicals # 1860454
Eparina FISHERBRAND # BP2425
Sulfatrim (SMZ) Qualitest NC9242720 (fisher)
Lysol IC E vinci la scientifica NC9745686 (fisher)
Vaccutainer BD # 8000813
Mouse restrainer Braintree scientifico # TV-150
Irradiator JL Pastore e Associati Mark I 68A
Citometro di flusso BD BD FACSCanto II
Citometro di flusso provetta Falco # 352052
Calibro digitale FISHERBRAND 14-648-17
Hemoccult ICT Beckman Coulter G0328QW

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678(2012).
  2. Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameli....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bone Marrow TransplantationFlow CytometryColitis InductionDextran SulfateCD45 1 CD45 2 MarkersWild Type MiceKnockout MiceBone Marrow IsolationHistology AnalysisCell Staining

Related Articles