Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo

Sommario

Il trapianto di midollo osseo fornisce un modo per modificare il genotipo delle cellule del midollo osseo derivate. Se il gene di interesse viene espresso in cellule di midollo osseo sia derivati ​​e non le cellule del midollo osseo derivate, trapianto di midollo osseo può modificare le cellule del midollo osseo derivate da un genotipo diverso senza cambiare la non-genotipo delle cellule del midollo osseo derivate.

Abstract

Per capire il ruolo di un gene nello sviluppo della colite, abbiamo confrontato le risposte dei topi wild-type e geni di interessi topi knockout carenti da colite. Se il gene d'interesse è espressa in cellule di midollo osseo derivate entrambe e non le cellule del midollo osseo derivate dell'ospite, tuttavia, è possibile differenziare il ruolo di un gene di interesse in cellule derivate dal midollo osseo e non midollo osseo cellule derivate da tecnica di trapianto di midollo osseo. Per modificare il midollo osseo derivate genotipo cellule dei topi, il midollo osseo originale di topi riceventi sono stati distrutti mediante irradiazione e poi sostituito da midollo osseo del donatore di nuovo genotipo diverso. Quando wild-type topi donatore di midollo osseo è stato trapiantato in topi knockout, potremmo generare topi wild-type con l'espressione del gene in cellule derivate dal midollo osseo. In alternativa, quando i topi knockout donatore di midollo osseo è stato trapiantato in topi wild-type destinatario, topi wild-type, senza gene d'interesse che esprimeda cellule di midollo osseo derivate sono state prodotte. Tuttavia, il trapianto di midollo osseo non può essere completa al 100%. Pertanto, abbiamo utilizzato cluster di differenziazione (CD) molecole (CD45.1 e CD45.2) come marcatori di cellule del donatore e del ricevente per monitorare la proporzione di cellule del midollo osseo del donatore ottenuti in topi riceventi e il successo del trapianto di midollo osseo. Topi wild-type con CD45.1 topi knockout con genotipo e CD45.2 genotipo sono stati utilizzati. Dopo irradiazione di topi riceventi, le cellule ossee donatore di midollo di diversi genotipi sono stati infusi nei topi riceventi. Quando il midollo osseo nuovo rigenerato di prendere in consegna la sua immunità, i topi sono stati sfidati da agenti chimici (destrano solfato di sodio, 5% di DSS) per indurre colite. Qui abbiamo anche mostrato il metodo per indurre colite in topi e valutare il ruolo del gene di interesse espresso da cellule di midollo osseo derivate. Se il gene d'interesse dalle cellule ossee derivate svolge un ruolo importante nello sviluppo della malattia (come Escherichiatis), il fenotipo dei topi riceventi con trapianto di midollo osseo può essere significativamente modificati. Alla fine della sperimentazione colite, il midollo osseo derivate cellule nel sangue e midollo osseo sono state marcate con anticorpi contro CD45.1 e CD45.2 e il loro rapporto quantitativo di esistenza potrebbe essere utilizzato per valutare il successo del trapianto di midollo osseo mediante citometria a flusso. Riuscito trapianto di midollo osseo dovrebbe mostrare una vasta maggioranza di genotipo dei donatori (in termini di marcatori molecola CD) nel genotipo destinatario sia nel midollo osseo e nel sangue di topi riceventi.

Protocollo

1. Prima-voi-iniziare Considerazioni tecniche

1. Si consiglia di utilizzare entrambi i C57/BL6 topi wild-type e topi knockout per l'esperimento perché i topi con le molecole CD corrispondenti si possono acquistare dai fornitori principali del mouse.
2. Poiché è difficile tenere traccia dei topi wild-type e topi knockout derivate cellule del donatore dopo il trapianto di midollo osseo, è necessario utilizzare CD45.1 topi per rappresentare topi wild-type. (CD45.1 C57/SJL topi WT magazzino Jackson Laboratories # 002014).
3. La maggior parte delle colonie del mouse sono CD45.2. I nostri topi knockout appartengono CD45.2 genotipo (in alternativa un CD45.2 fonte topi WT: Jackson Laboratories # 000664). La determinazione di CD45.1 o CD45.2 genotipo può essere eseguita utilizzando la citometria a flusso del midollo osseo e del sangue periferico come indicato al punto 7 in questo protocollo.
4. I topi dopo l'irradiazione hanno compromesso l'immunità. Tenere topi in patogeni servizio gratuito.
5. Funzionamento di irradiatore richiede di sicurezza speciale clearance e formazione. Per risparmiare tempo nei processi di formazione e di approvazione, è meglio collaborare con un laboratorio con personale qualificato che è in grado di operare l'irradiatore.
6. Molte istituzioni hanno laboratori di citometria a flusso con i tecnici esperti. Per ridurre al minimo i problemi con il funzionamento di citometria a flusso, è meglio per discutere il vostro piano di flusso citometria a sperimentare con il tecnico esperto prima di iniziare.
7. I topi sono stati assegnati in questo modo (10 topi per gruppo):

Gruppo		Donatori di midollo osseo al destinatario	Trattamento
La	BM scambio	CD45.1 WT a CD45.2 KO	DSS colite
B			Acqua normale controllo
C	BM scambio	CD45.2 KO a CD45.1 WT	DSS colite
D			Acqua normale controllo
E	Finzione	CD45.1 WT a CD45.1 WT	DSS colite
F			Acqua normale controllo
Sol	Finzione	CD45.2 KO a CD45.2 KO	DSS colite
H			Acqua normale controllo

* Una breve illustrazione del protocollo sperimentale è mostrato in Figura 1.

2. Destinatario Mice irradiazione

1. I topi sono allevati e tenuti in esente da organismi patogeni struttura. Luogo in topi torta irradiazione autoclavato con filtro. Mettere un mouse in ciascuno slot di torta di irradiazione. Mettere la torta in irradiatore e assicurarsi che il giradischi e la torta si rivolgono.
2. Accendere la pompa ad ariaper la ventilazione. Chiudere la porta irradiatore e bloccarlo.
3. Irradiare i topi con 1000 rad (che è equivalente a 10 Gy) circa 10 minuti (a seconda della fonte di radiazione e emivita). Da questo punto di tempo, i topi irradiati sono immuno-compromessi e hanno l'immunità debole contro le infezioni. Dopo l'irraggiamento, prendere la torta fuori e mettere in un recipiente sterile per il trasporto alla biosicurezza armadio in stabulario. Evitare di esporre i topi all'ambiente esterno per minimizzare possibilità di infezione.
4. In armadio biosicurezza, trasferire i topi in gabbia topo autoclave con biancheria da letto autoclavato (4 topi per gabbia Aggiungi nuovo acqua sterile con sospensione sulfatrim -. 3,12 ml per 100 ml di acqua).
5. Avvolgere la bottiglia d'acqua con un foglio di alluminio come gli antibiotici sono sensibili luce. Agitare per miscelare il flacone soluzione sulfatrim ben prima del caricamento alla gabbia.

3. Bone Marrow Donor Estrazione

1. Sacrificio topi con anidride carbonica o isoflurzione e poi immergerlo in soluzione disinfettante 1:200. Spruzzare i topi con etanolo 70% per bagnare la pelle e sezionare ossa aperte.
2. Immergere gli strumenti di dissezione in etanolo al 70% per la sterilizzazione.
3. Eseguire la dissezione in un armadio biosicurezza. Utilizzare gli strumenti di dissezione sterili per esporre l'omero, femore, tibia e perone ossa, libero di attaccarsi muscoli e legamenti.
4. Tagliare le due estremità delle ossa per mostrare il midollo osseo rosso. Tenere le ossa con una pinza. Lavare il midollo osseo rosso con PBS freddo con siringa da 3 ml e aghi 25G di una capsula di Petri. Lavare da entrambe le estremità delle ossa per produrre le cellule del midollo osseo più.
5. Utilizzare 6 siringhe ml e 18G1 / 2 aghi per rompere le spine rosse del midollo osseo attraverso ripetute aspirazione ed espulsione. Trasferire midollo osseo con 50 ml provette Falcon.
6. Girare il midollo osseo nel 1800 rpm per 5 min a 4 ° C. Gettare il surnatante, risospendere pellet vortexando per 5-10 sec.
7. Diluire 10 volte tampone di lisi degli eritrociti con acqua sterile. Annunciod 1X tampone di lisi RBC (5 ml per topo donatore), vortex ancora per 5 sec e mantenere esattamente 3 min a temperatura ambiente.
8. Dopo 3 minuti, riempire i tubi con 20 ml di PBS freddo per fermare la lisi e mescolare. Versare il contenuto attraverso un colino cellula 40 micron direttamente in un nuovo tubo da 50 ml Falcon.
9. Sciacquare i tubi originali con 5 ml di PBS e trasferire al filtro cella pure. Top a 50 ml con PBS e mescolare.

4. Conteggio osseo cellule del donatore di midollo

1. Aggiungere 100 pl di Trypan blu ad un tubo Eppendorf e 100 pl di sospensione di midollo osseo di un tubo Eppendorf e mescolare. Pipettare la miscela macchiato cella per un emocitometro.
2. La quantità di cellule è calcolato conta totale delle cellule del midollo osseo che vivono in provette Falcon = numero di cellule non colorate in 16 quadrati x 2 (a causa della diluizione Trypan blu) x 10.000 x 50 ml
3. Centrifugare le cellule del midollo osseo in provette Falcon da 50 ml a 2000 rpm per 5 min a 4 ° C.
4. Rimuovere il surnatante. Basatosulle conta cellulare totale, risospendere il pellet con PBS per 1 x 10 ⁸ cellule per ml

5. Infusione di topi riceventi

1. Riscaldare le topi riceventi su un tappetino di calore e sotto una lampada di riscaldamento. Mettere i topi riceventi in dispositivo di immobilizzazione. Iniettare 1 x 10 ⁷ cellule per topo in 100-200 microlitri via endovenosa.
2. L'iniezione di midollo osseo del donatore deve essere effettuato tra 4-24 ore dopo l'irradiazione.
3. Tieniti 4 topi iniettati per gabbia. Mantenere i topi riceventi iniettati in gabbie autoclave con acqua trattata con antibiotici per le prime 4 settimane di patogeni stabulario libero e lasciare che i topi riconquistare l'immunità. Gabbie Change, trattata con antibiotici acqua e cibo ogni 4 giorni per mantenere l'igiene.

6. L'induzione di colite e di valutazione del colite

1. 4 settimane dopo il trapianto di midollo osseo e di irradiazione, passare l'acqua normale senza antibiotici e mantenere i topi per 2 settimane per riguadagnare la loro normalegut microflora.
2. 6 settimane dopo l'iniezione di midollo osseo, misurare il peso corporeo iniziale. Alcuni topi sono date 5% destrano solfato in acqua potabile ad libitum per indurre colite. Alcuni topi sono dato acqua potabile regolare solo come gruppi di controllo normali.
3. 5 giorni dopo, prelevare il sangue periferico, il trasferimento di eparina provette (Vacutainer) e tenere in ghiaccio. Piscina il sangue da 4 topi a 1 tubo. Combinano 300 microlitri di sangue con 300 pl di tampone di colorazione della cellula = 600 microlitri. Dividere il sangue per 5 provette Eppendorf, ciascuno con 100 ul.
4. Sacrifica i topi con l'anidride carbonica o isoflurano. Valutare gli spartiti danni macroscopici (si prega di fare riferimento a un'altra pubblicazione dei video JOVE per i dettagli ^1). Misurare modifica di peso corporeo. Misurare la lunghezza dell'intestino e spessore con calibro digitale. Osservare consistenza feci (duro, morbido o di sangue). Determinare sangue occulto nelle feci con Hemooccult. Staccare i tessuti del colon e fissare in formalina per la colorazione H & E.
5. Dissect 1 femore bone per topo, estrarre il midollo osseo e lavare il midollo osseo con PBS freddo tramite l'ago 25G e siringa da 1 ml. Girone 4 midollo osseo tappi a 1 tubo e tenere in ghiaccio.
6. Versare il midollo osseo a Petri, taglio la spina midollo osseo con l'ago 18G e 5 volte siringa ml più fino a quando non spina midollo osseo è presente.
7. Spin down con 1.500 rpm per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere con 600 microlitri di buffer colorazione delle cellule. Dividere il midollo osseo risospeso a 5 provette Eppendorf, ciascuno con 100 ul.

7. Controllo qualità del trapianto di midollo osseo mediante citometria a flusso

1. Etichettare ogni provette di sangue o di midollo osseo # 1-5:
2. Preparare la miscela di anticorpi per ogni rispettivo tubo al buio.

# 1 Nessun anticorpo
# 2 30 microlitri controllo isotipico FITC + 30 pl PE isotipo di controllo + 15 pl CD16/32 blocco
# 3 30 microlitri FITC CD45.1 Ab + 15 pl CD16/32 blocco
# 4 30 microlitri PECD45.2 Ab + 15 pl CD16/32 blocco
# 5 30 microlitri FITC CD45.1 Ab + 30 microlitri PE CD45.2 Ab + 15 pl CD16/32 blocco

Aggiungi nulla da sangue o del midollo osseo di esempio # 1

Aggiungere 5 ml di miscela di anticorpi # 2 per ciascun campione di sangue o midollo osseo # 2

Aggiungere 3 ml di miscela di anticorpi # 3 per ciascun campione di sangue o midollo osseo # 3

Aggiungere 3 ml di miscela di anticorpi # 4 per ciascun campione di sangue o midollo osseo # 4

Aggiungere 5 ml di miscela di anticorpi ° 5 di ciascun campione di sangue o midollo osseo # 5

3. Conservare in buio in ghiaccio per 30 min.
4. Aggiungere 2 ml di 1X RBC Lysis Buffer ad ogni provetta. Conservare al buio in ghiaccio per 15 min.
5. Centrifugare le cellule a 1.500 rpm, 5 min a 4 ° C. (GH 3,8 rotore, 1.500 giri = 350 xg) Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet con 500 microlitri di buffer colorazione cella al buio, brevemente e poi vortice.
6. Controllare il CD45.1 (che rappresenta WT) e CD45.2 (rappresentando KO) nel sangue immunocolorate e campioni di midollo osseo mediante citometria a flusso. Selezionare FITC per rappresentare WT CD45.1 e PE per rappresentare KO CD45.2.
7. Analizzare i risultati citometria a flusso dal software FlowJo. Calcolare il rapporto di FITC: Rapporto PE o PE: rapporto FITC per determinare se il genotipo dei donatori è genotipo dominante nel sangue e nel midollo osseo.

Risultati

Se il gene d'interesse gioca un ruolo significativo in cellule immunitarie durante lo sviluppo della colite, i topi che hanno ricevuto midollo osseo di genotipo diverso attraverso il trapianto di midollo osseo (WT per KO o KO per WT) dovrebbe avere un'alterata risposta alla colite DSS. Uno dei parametri più importanti per determinare la gravità della colite è la H & E colorazione dei tessuti del colon. Colon cambiamenti della struttura dei tessuti e dei segni di infiammazione può essere quantitativamente valutati da...

Discussione

Questo approccio di midollo osseo trapianto è adatto per la ricerca di immunologia colite, infezioni, cancro, obesità e altre malattie. Questo esperimento midollo osseo trapianto è necessaria quando il gene d'interesse è espresso in entrambi derivate dal midollo osseo e non le cellule del midollo osseo derivate e il gene d'interesse si sospetta di mediare malattia da parte delle cellule da entrambe le popolazioni. Per esempio, peptide antimicrobico cathelicidin viene mostrato per modulare colite acuta. Ma è espr...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
Cella colorazione tampone	Biolegend	# 420201
10X tampone di lisi RBC	Biolegend	# 420301
FITC isotipo di controllo del mouse	Biolegend	# 400207
PE del mouse isotipo di controllo	Biolegend	# 400211
PE anti-topo CD45.2	Biolegend	# 109807
FITC anti-topo CD45.1	Biolegend	# 110705
Anti-mouse CD16/32 blocco	Biolegend	# 101301
40 filtro cella pm	FISHERBRAND	# 22363547
PBS 1X	MP Biomedicals	# 1860454
Eparina	FISHERBRAND	# BP2425
Sulfatrim (SMZ)	Qualitest	NC9242720 (fisher)
Lysol IC	E vinci la scientifica	NC9745686 (fisher)
Vaccutainer	BD	# 8000813
Mouse restrainer	Braintree scientifico	# TV-150
Irradiator	JL Pastore e Associati	Mark I 68A
Citometro di flusso	BD	BD FACSCanto II
Citometro di flusso provetta	Falco	# 352052
Calibro digitale	FISHERBRAND	14-648-17
Hemoccult ICT	Beckman Coulter	G0328QW