Il trapianto di midollo osseo fornisce un modo per modificare il genotipo delle cellule del midollo osseo derivate. Se il gene di interesse viene espresso in cellule di midollo osseo sia derivati e non le cellule del midollo osseo derivate, trapianto di midollo osseo può modificare le cellule del midollo osseo derivate da un genotipo diverso senza cambiare la non-genotipo delle cellule del midollo osseo derivate.
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Articolo metodologico
Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Per capire il ruolo di un gene nello sviluppo della colite, abbiamo confrontato le risposte dei topi wild-type e geni di interessi topi knockout carenti da colite. Se il gene d'interesse è espressa in cellule di midollo osseo derivate entrambe e non le cellule del midollo osseo derivate dell'ospite, tuttavia, è possibile differenziare il ruolo di un gene di interesse in cellule derivate dal midollo osseo e non midollo osseo cellule derivate da tecnica di trapianto di midollo osseo. Per modificare il midollo osseo derivate genotipo cellule dei topi, il midollo osseo originale di topi riceventi sono stati distrutti mediante irradiazione e poi sostituito da midollo osseo del donatore di nuovo genotipo diverso. Quando wild-type topi donatore di midollo osseo è stato trapiantato in topi knockout, potremmo generare topi wild-type con l'espressione del gene in cellule derivate dal midollo osseo. In alternativa, quando i topi knockout donatore di midollo osseo è stato trapiantato in topi wild-type destinatario, topi wild-type, senza gene d'interesse che esprimeda cellule di midollo osseo derivate sono state prodotte. Tuttavia, il trapianto di midollo osseo non può essere completa al 100%. Pertanto, abbiamo utilizzato cluster di differenziazione (CD) molecole (CD45.1 e CD45.2) come marcatori di cellule del donatore e del ricevente per monitorare la proporzione di cellule del midollo osseo del donatore ottenuti in topi riceventi e il successo del trapianto di midollo osseo. Topi wild-type con CD45.1 topi knockout con genotipo e CD45.2 genotipo sono stati utilizzati. Dopo irradiazione di topi riceventi, le cellule ossee donatore di midollo di diversi genotipi sono stati infusi nei topi riceventi. Quando il midollo osseo nuovo rigenerato di prendere in consegna la sua immunità, i topi sono stati sfidati da agenti chimici (destrano solfato di sodio, 5% di DSS) per indurre colite. Qui abbiamo anche mostrato il metodo per indurre colite in topi e valutare il ruolo del gene di interesse espresso da cellule di midollo osseo derivate. Se il gene d'interesse dalle cellule ossee derivate svolge un ruolo importante nello sviluppo della malattia (come Escherichiatis), il fenotipo dei topi riceventi con trapianto di midollo osseo può essere significativamente modificati. Alla fine della sperimentazione colite, il midollo osseo derivate cellule nel sangue e midollo osseo sono state marcate con anticorpi contro CD45.1 e CD45.2 e il loro rapporto quantitativo di esistenza potrebbe essere utilizzato per valutare il successo del trapianto di midollo osseo mediante citometria a flusso. Riuscito trapianto di midollo osseo dovrebbe mostrare una vasta maggioranza di genotipo dei donatori (in termini di marcatori molecola CD) nel genotipo destinatario sia nel midollo osseo e nel sangue di topi riceventi.
Protocollo
1. Prima-voi-iniziare Considerazioni tecniche
- Si consiglia di utilizzare entrambi i C57/BL6 topi wild-type e topi knockout per l'esperimento perché i topi con le molecole CD corrispondenti si possono acquistare dai fornitori principali del mouse.
- Poiché è difficile tenere traccia dei topi wild-type e topi knockout derivate cellule del donatore dopo il trapianto di midollo osseo, è necessario utilizzare CD45.1 topi per rappresentare topi wild-type. (CD45.1 C57/SJL topi WT magazzino Jackson Laboratories # 002014).
- La maggior parte delle colonie del mouse sono CD45.2. I nostri topi knockout appartengono CD45.2 genotipo (in alternativa ....
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Risultati
Se il gene d'interesse gioca un ruolo significativo in cellule immunitarie durante lo sviluppo della colite, i topi che hanno ricevuto midollo osseo di genotipo diverso attraverso il trapianto di midollo osseo (WT per KO o KO per WT) dovrebbe avere un'alterata risposta alla colite DSS. Uno dei parametri più importanti per determinare la gravità della colite è la H & E colorazione dei tessuti del colon. Colon cambiamenti della struttura dei tessuti e dei segni di infiammazione può essere quantitativamente val.......
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Discussione
Questo approccio di midollo osseo trapianto è adatto per la ricerca di immunologia colite, infezioni, cancro, obesità e altre malattie. Questo esperimento midollo osseo trapianto è necessaria quando il gene d'interesse è espresso in entrambi derivate dal midollo osseo e non le cellule del midollo osseo derivate e il gene d'interesse si sospetta di mediare malattia da parte delle cellule da entrambe le popolazioni. Per esempio, peptide antimicrobico cathelicidin viene mostrato per modulare colite acuta. Ma è espr.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da pilota e Borsa di studio di fattibilità da UCLA-CURE Center, il morbo di Crohn e Colite Foundation of Career Development Award America (# 2691) e Istituto Superiore di Sanità NIDDK K01 (DK084256) finanziamenti per Hon Wai Koon.
Midollo osseo irradiazione operazione è stata assistita da Bernard Levin e cucina Scott di UCLA Center for Research mouse AIDS / umano Core Facility Chimera. Citometria di flusso operazione è stata assistita da impianto UCLA Nucleo Vector.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| Cella colorazione tampone | Biolegend | # 420201 | |
| 10X tampone di lisi RBC | Biolegend | # 420301 | |
| FITC isotipo di controllo del mouse | Biolegend | # 400207 | |
| PE del mouse isotipo di controllo | Biolegend | # 400211 | |
| PE anti-topo CD45.2 | Biolegend | # 109807 | |
| FITC anti-topo CD45.1 | Biolegend | # 110705 | |
| Anti-mouse CD16/32 blocco | Biolegend | # 101301 | |
| 40 filtro cella pm | FISHERBRAND | # 22363547 | |
| PBS 1X | MP Biomedicals | # 1860454 | |
| Eparina | FISHERBRAND | # BP2425 | |
| Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (fisher) | |
| Lysol IC | E vinci la scientifica | NC9745686 (fisher) | |
| Vaccutainer | BD | # 8000813 | |
| Mouse restrainer | Braintree scientifico | # TV-150 | |
| Irradiator | JL Pastore e Associati | Mark I 68A | |
| Citometro di flusso | BD | BD FACSCanto II | |
| Citometro di flusso provetta | Falco | # 352052 | |
| Calibro digitale | FISHERBRAND | 14-648-17 | |
| Hemoccult ICT | Beckman Coulter | G0328QW |
Riferimenti
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678(2012).
- Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameli....
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Ristampe e permessi
