Abbiamo sviluppato una piattaforma software che utilizza Imaris Neuroscienze, ImarisXT e MATLAB per misurare i cambiamenti nella morfologia di una forma indefinita preso da tridimensionale fluorescenza confocale di singole cellule. Questo nuovo approccio può essere usato per quantificare i cambiamenti nella forma cellulare dopo l'attivazione del recettore e rappresenta quindi un possibile strumento aggiuntivo per la scoperta di farmaci.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Uno strumento di analisi che quantifica Modifiche morfologia cellulare dalle immagini a fluorescenza tridimensionali
In questo articolo
Sommario
Abstract
I più comuni strumenti di analisi software disponibili per la misurazione della fluorescenza sono le immagini per i dati bidimensionali (2D) che si basano su impostazioni manuali per l'inclusione e l'esclusione dei punti di dati e computer-aided pattern recognition per rafforzare l'interpretazione ei risultati delle analisi. È diventato sempre più importante essere in grado di misurare immagini di fluorescenza costruiti dataset tridimensionali (3D) per essere in grado di catturare la complessità delle dinamiche cellulari e capire la base della plasticità cellulare all'interno di sistemi biologici. Strumenti sofisticati di microscopia hanno permesso la visualizzazione di immagini 3D di fluorescenza attraverso l'acquisizione di immagini multispettrali di fluorescenza e potente software di analisi che ricostruisce le immagini da pile confocale che poi forniscono una rappresentazione 3D delle immagini raccolte 2D. Advanced Design metodi basati Stereology sono progrediti dal ravvicinamento e le ipotesi di original model-based stereology 1, anche in sezioni di tessuto complesse 2. Nonostante questi progressi scientifici in microscopia, rimane una necessità per un metodo analitico automatizzato che sfrutta appieno i dati intrinseci 3D per permettere l'analisi e la quantificazione delle variazioni complesse della morfologia cellulare, la localizzazione delle proteine e traffico recettore.
Le attuali tecniche disponibili per quantificare immagini di fluorescenza sono Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) e Image J (NIH) che forniscono l'analisi manuale. Imaris (Andor Technology, Belfast, Irlanda del Nord), il software fornisce la funzione MeasurementPro, che consente la creazione manuale di punti di misura che possono essere inseriti in un volume o un'immagine disegnata su una serie di sezioni 2D per creare un oggetto 3D. Questo metodo è utile per singolo clic misurazioni di punti per misurare una distanza di linea tra due oggetti o per creare un poligono che racchiude una regione di interesse, ma è difficile da applicare a complex strutture di rete cellulare. Filament Tracer (Andor) consente il rilevamento automatico del neuronale 3D filamento simile tuttavia, questo modulo è stato sviluppato per misurare strutture definite come i neuroni, che sono costituite da assoni, dendriti e spine (struttura ad albero). Questo modulo è stato ingegnosamente utilizzato per effettuare misurazioni morfologiche cellule non neuronali 3, tuttavia, i dati di uscita di fornire informazioni di un'estesa rete cellulare utilizzando un software che dipende da una forma cella definita piuttosto che essere una forma amorfa modello cellulare. Per superare il problema di analizzare amorfo a forma di cellule e rendere il software più adatto a una domanda di biologico, Imaris sviluppato cella Imaris. Questo è stato un progetto scientifico con la Eidgenössische Technische Hochschule, che è stato sviluppato per calcolare il rapporto tra cellule e organelli. Mentre il software consente l'individuazione di vincoli biologici, forzando un nucleo per cellamediante membrane cellulari di cellule segmento, esso non può essere utilizzato per analizzare dati di fluorescenza non sono continuativi perché idealmente costruisce superficie cellulare senza spazi vuoti. A nostra conoscenza, per il momento non modificabile dall'utente approccio automatizzato che fornisce informazioni morfometrica 3D da immagini di fluorescenza è stato sviluppato che consente di ottenere informazioni spaziali cellulare di forma indefinita (Figura 1).
Abbiamo sviluppato una piattaforma di analisi utilizzando il Imaris modulo software di base e Imaris XT interfacciato con MATLAB (Mat Works, Inc.). Questi strumenti consentono la misurazione 3D di cellule senza una predefinita forma e incoerenti con componenti di rete fluorescenza. Inoltre, questo metodo consentirà ai ricercatori che hanno esteso le competenze nei sistemi biologici, ma non familiarità per applicazioni informatiche, effettuare quantificazione dei cambiamenti morfologici nelle dinamiche cellulari.
Protocollo
1. Tridimensionale analisi morfometrica delle variazioni fenotipiche cella singola
- Umane embrionali renali (HEK293) cellule sono state trasfettate con emoagglutinina (HA)-tagged fattore di rilascio della corticotropina recettore-2 (CRF-R2), una proteina recettore accoppiato G (GPCR) come precedentemente descritto 4, 5.
- Le cellule sono state lasciate non trattate (nessun trattamento, NT), stimolate con il CRF-R2 ligando endogeno, fattore di rilascio della corticotropina, CRF (1 pM, 30 min), o pretrattato con un selettivo CRF-R2 antagonista, anti-sauvagine 30 (AS -30, 1 pM, 30 min) prima del trattamento agonista.
- Le cellule son....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Abbiamo mostrato che il trattamento CRF indotto un significativo cambiamento nella morfologia e localizzazione del CRF-R2. La variazione CRF-R2 è stata inibita mediante trattamento antagonista selettivo. Abbiamo dimostrato che modifiche recettore non sono stati rilevati e non può essere misurata utilizzando le tecniche standard 2D multispettrali. La capacità di studiare complesse immagini 3D è fondamentale per incorporare la complessità dei parametri biologici per l'analisi morfometrica. Siamo stati in grado di effe.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Biological Imaging Development Center (BIDC) dell'Università della California, a San Francisco per l'uso del Imaris, Imaris XT e Matlab. Ringraziamo V. Kharazia per l'assistenza tecnica e AT Henry, LK Floren, L. Daitch per il loro contributo alla redazione del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento da parte dello Stato della California Medical Research su abuso di alcool e di sostanze attraverso la UCSF di SEB, il National Institutes of Health: 1R21DA029966-01 e di aggiudicazione NIH pista veloce per schermare la raccolta MLSMR di SEB, UCSF Facoltà di Farmacia ( Ufficio di Presidenza e Farmacia Clinica) e la Scuola....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Di rene embrionale umano (HEK293) | Tipo americano Culture Collection | CRL-1573 | |
| Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Siero bovino fetale (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonale anti-HA.11 (IgG 1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | ; |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
Riferimenti
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262(2009).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
