Presentiamo un metodo per raccogliere il fluido cerebrospinale (CSF) e per creare un sistema che manca CSF nel sistema ventricolare cerebrale embrionale zebrafish. Ciò consente un ulteriore esame della composizione CSF e il suo fabbisogno durante lo sviluppo embrionale del cervello.
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Articolo metodologico
Drenaggio manuale dei ventricoli cerebrali embrionali zebrafish
In questo articolo
Sommario
Abstract
Liquido cerebrospinale (CSF) è un fluido ricco di proteine contenute nei ventricoli cerebrali. E 'presente durante le prime fasi dello sviluppo embrionale dei vertebrati e persiste per tutta la vita. Adulto CSF è pensato per attutire il cervello, rimuovere i rifiuti, e portare secreta 1,2 molecole. Nell'embrione adulti e anziani, la maggior parte di CSF è fatta dal plesso coroide, una serie di regioni altamente vascolarizzati secretori adiacenti al cervello ventricoli 3-5. In zebrafish, la coroide plesso è completamente formato a 144 dopo la fecondazione ore (HPF) 6. Prima di questo, negli embrioni dei vertebrati sia zebrafish e altre cui mouse, una quantità significativa di embrionale CSF (eCSF) è presente. Questi dati e studi suggeriscono che il pulcino è neuroepitelio secretoria presto nello sviluppo e può essere la principale fonte di eCSF prima del plesso coroide sviluppo 7.
eCSF contiene circa tre volte più proteine than adulto CSF, suggerendo che essa può avere un ruolo importante durante lo sviluppo 8,9. Studi in pulcino e topo dimostrano che i fattori secreti nel eCSF, pressione del fluido, o una combinazione di questi, sono importanti per la neurogenesi, sopravvivenza espressione genica, la proliferazione cellulare, e nella cella neuroepitelio 10-20. Analisi proteomica di umano, ratto, topo, e pulcino eCSF hanno identificato molte proteine che potrebbero essere necessari per la funzione LCR. Questi includono componenti della matrice extracellulare, apolipoproteine, proteine che regolano la pressione osmotica, e proteine coinvolte nella morte cellulare e proliferazione 21-24. Tuttavia, le funzioni complesse del eCSF sono largamente sconosciuti.
Abbiamo sviluppato un metodo per la rimozione eCSF dai ventricoli cerebrali zebrafish, consentendo così l'identificazione dei componenti eCSF e per l'analisi del fabbisogno eCSF durante lo sviluppo. Anche se più eCSF possono essere raccolti da altri vertebrati sistemi with embrioni più grandi, eCSF possono essere raccolti fin dalle prime fasi di sviluppo zebrafish, e in condizioni genetiche o ambientali che portano a volume anormale ventricolo del cervello o la morfologia. La rimozione e la raccolta di eCSF permette l'analisi di spettrometria di massa, l'indagine della funzione eCSF, e la reintroduzione di elementi selezionati nei ventricoli di test la loro funzione. Così l'accessibilità del zebrafish precoce consente un'analisi dettagliata della funzione eCSF durante lo sviluppo.
Protocollo
1. Preparazione Aghi microiniezione e tram cellulare
- Riempire Eppendorf CellTram olio apparato microiniettore con olio minerale secondo le istruzioni del produttore.
- Preparare aghi microiniezione tirando tubi capillari con Sutter estrattore ago strumenti.
- Montare ago su micromanipolatore collegato a Eppendorf CellTram.
- Attentamente rompere la punta dell'ago. Per le dimensioni della punta uniforme, misurare con un micrometro, o confrontare ad un ago di riferimento.
- Riempire la lunghezza dell'ago con olio, utilizzando il CellTram per spingere l'olio per tutta la lunghezza, facendo attenzione ad evitare even....
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Risultati
Un esempio di un ventricolo cerebrale drenato viene mostrato nella Figura 1B-C. Ventricoli cerebrali sono crollate, poiché non hanno eCSF (Figura 1B vs C). Come visto in immagini dorsali (Figura 1B-C, e la Figura 2A-D) neuroepitelio romboencefalo fa mantenere la sua morfologia caratteristica e sembra essere aperta nonostante la mancanza di eCSF probabilmente dovuto robuste cerniera punti. Tuttavia, viste laterali (Figura 2A'-D ')
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Discussione
L'uso di questa tecnica per drenare manualmente eCSF dai ventricoli cerebrali zebrafish sarà utile per determinare la necessità di eCSF durante lo sviluppo. Inoltre, questa tecnica consente descrizione del profilo proteico eCSF nel corso dello sviluppo embrionale. Identificazione di proteine differenti durante questo periodo consentirà ulteriori indagini sul funzionamento del CSF e il suo ruolo potenziale durante lo sviluppo del cervello. In amnioti, alcuni fattori di cui eCSF (IGF2, FGF2, acido retinoico, e apoli.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute for Mental Health, e la National Science Foundation. Un ringraziamento particolare al Dr. Jen Gutzman, Dr. Amanda Dickinson e altri membri di laboratorio esclusivo per molte utili discussioni e critiche costruttive, e di Olivier Paugois per l'allevamento dei pesci di esperti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| Eppendorf CellTram olio | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Olio minerale | Sigma | M8410 | |
| Tricaine polvere | Sigma | A5040 | |
| Tubi capillari | FHC Inc. | 30-30-1 |
Riferimenti
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebros....
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