Particelle di adenovirus sono progettati per contenere l'innaturale azidohomoalanine analogo dell'acido amino o lo zucchero azido O-GlcNAz. Il gruppo azide di ciascuno è legato chemoselectively via "scattano" le reazioni di chimica come mezzo di modifica della superficie virale.
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Articolo metodologico
Modifica Chemoselective delle superfici virali tramite Chimica Click Bioorthogonal
In questo articolo
Sommario
Abstract
La modifica di particelle virali ha ricevuto una quantità significativa di attenzione per il suo potenziale impatto enorme per terapia genica, le applicazioni oncolitici e sviluppo di vaccini. 1,2,3 attuali approcci per modificare le superfici virali, che sono prevalentemente a base genetica, spesso soffrono di attenuazione della produzione di virus, l'infettività e cellulari di trasduzione. 4,5 utilizzando la chimica chemoselective click, abbiamo sviluppato un approccio diretto alternativo che evita questi problemi, pur rimanendo allo stesso tempo estremamente flessibile e accessibile. 1,2
L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare l'efficacia di utilizzare la chimica bioorthogonal click per modificare la superficie di particelle di adenovirus di tipo 5. Questo processo a due fasi può essere utilizzato sia terapeuticamente 1 o analiticamente, 2,6 quanto consente di ligazione chemoselective di molecole targeting, coloranti o altre molecole di interesse su proteinepre-etichettati con tag azide. I tre principali vantaggi di questo metodo sono che (1) etichettatura metabolica dimostra poco o nessun impatto sulla fitness virale, 1,7 (2) una vasta gamma di leganti effettrici può essere utilizzato, e (3) è notevolmente veloce, affidabile e di facile accesso. 1,2,7
Nella prima fase di questo procedimento, le particelle di adenovirus sono prodotti tenendo sia azidohomoalanine (Ah, un surrogato metionina) o zucchero innaturale O-legato N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), entrambi i quali contengono l'azide (N-3) funzionali gruppo. Dopo purificazione dei azide modificati particelle virali, una sonda alchino contenente la parte fluorescente TAMRA è ligato in modo chemoselective alle proteine pre-marcate o glicoproteine. Infine, un SDS-PAGE analisi viene eseguita per dimostrare la legatura successo della sonda sulle proteine del capside virale. Incorporazione Aha è mostrato per etichettare tutti i capside viraleproteine (esone, Penton e fibra), mentre O-GlcNAz risultati incorporazione di etichettatura di Fiber solo.
In questo campo in continua evoluzione, diversi metodi per azide-alchino legatura sono stati sviluppati con successo, ma solo i due che abbiamo trovato per essere più conveniente sono qui dimostrato - strain-promosso azide-alchino cicloaddizione (SPAAC) e rame-catalizzata azide-alchino cicloaddizione (CuAAC) in atmosfera deossigenata.
Protocollo
Fare riferimento alla Tabella 1 per la preparazione di tutti i media, tamponi e soluzioni di riferimento in questo protocollo.
1. Produzione di Aha-etichetta Adenovirus
- Preparare undici da 100 mm piatti di coltura di tessuto di cellule umane embrionali di rene (HEK 293) mantenuti in HEK 293 mezzo di crescita delle cellule (vedi Tabella 1) a 37 ° C fino a quando non hanno raggiunto l'80 - 90% confluenza. (Nota:. Culture confluenza con oltre il 90% possono essere difficili da infettare e non può produrre virus come desiderato)
- Allentare le cellule in uno dei piatti rimuovendo prima ....
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Discussione
Lo sviluppo di reazioni click chemoselective e bioorthogonal, compresi quelli di azidi, è un settore in rapida evoluzione della ricerca, e successivamente vi è un numero crescente di queste reazioni da scegliere per le applicazioni bioconiugazione. Abbiamo ristretto il campo di applicazione di questo protocollo per includere solo due metodi che sono stati scelti per la loro utilità nel nostro laboratorio proprio e la disponibilità commerciale di tutti i reagenti.
Nel primo percorso tale - st.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere la NSF per il finanziamento (cbet-0846259).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | |
| Adenovirus di tipo 5 (Ad5) contenente un transgene GFP | BCBC | 391 | |
| Rene umano embrionale (HEK 293) cellule | ATCC | CRL-1573 | |
| Dulbeccòs Modified Eaglès Medium (DMEM), Glucosio alto | Invitrogen | 11965-092 | |
| Dulbeccòs Modified Eaglès Medium, no metionina, cisteina no (DMEM-Met /-Cys), Glucosio alto | Invitrogen | 21013-024 | |
| Bovine di siero di vitello | Invitrogen | 16170-078 | |
| Penicillina - streptomicina 100 × Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0,5% tripsina-EDTA (10 ×) | Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 millimetri Culture Dish cellula, tessuto-cultura polistirene trattata | BD Falcon | 353003 | |
| Coltura cellulare CO 2 incubatore | |||
| Emocitometro | |||
| Biosicurezza cabinet | |||
| Sterile filtro a siringa (0,2 um, acetato di cellulosa) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europa) | |
| Avanti JE centrifuga | Beckman Coulter | 369001 | |
| Provette coniche (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 | |
| Tube, pareti sottili, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 | |
| Ultracentrifuga dotato di un 41 SW e SW 60 rOTOR | Beckman | ||
| Biopur Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 | |
| Centrifugare 5418 | Eppendorf | 5418 | |
| Centri-Sep gel filtrazione di spin colonne | Princeton separazioni | CS-901 | |
| Ago sterile, 18 gauge | |||
| Borsa azoto guanto (se CuAAC deossigenata deve essere eseguito) | |||
| Dewar pallone | |||
| L'azoto liquido | |||
| Elettroforesi delle cellule | |||
| Gel fluorescente all'interno dello scanner | |||
| Pronta Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 | |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 | |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | ||
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) | Invitrogen | C33365 | |
| Thermo Scientific | 88905 | ||
| Sigma-Aldrich | A7480 | ||
| Bathophenanthroline disolfonico (BDA) sale disodico | MP Biomedicals | 0215011201 | |
| Dimetilsolfossido (DMSO) | |||
| Metanolo | |||
| Tris base (tris (idrossimetil) amminometano) | |||
| Disodico fosfato (Na2 HPO 4) | |||
| Soluzione salina tamponata (PBS) | |||
| 1M HCl | |||
| Glicerina | |||
| Albumina di siero bovino | |||
| L-cisteina | |||
| L-metionina | |||
| SDS (dodecil solfato di sodio) | |||
| 2-mercaptoetanolo | |||
| Glycine | |||
| Blu di bromofenolo | |||
| Cloruro di cesio (CsCl) | & Nbsp; | ||
| Di rame (I), bromuro (CuBr) | |||
| Cloruro di calcio (CaCl 2) | |||
| Cloruro di potassio (KCl) | |||
| Magnesio cloruro (MgCl 2) | |||
| Cloruro di sodio (NaCl) | |||
| Alchino sonda per * CuAAC | |||
| TAMRA acetilenici | Invitrogen | T10183 | |
| Strained Sonda alchino per * SPAAC | |||
| TAMRA Dibo acetilenici | Invitrogen | C10410 |
* I venditori notevoli di reagenti chimici clic e kit includono Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Fare clic su Strumenti Chimica e Baseclick. Una varietà di coloranti alchino e ligandi di targeting possono essere trovati nei cataloghi di questi venditori.
Riferimenti
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S.
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Ristampe e permessi
