Le vescicole unilamellari di grandi dimensioni (LUV) definite dal punto di vista biochimico rappresentano un sistema modello conveniente per analizzare le interazioni della famiglia BCL-2, con implicazioni dirette nella migliore comprensione della via mitocondriale dell'apoptosi. Vengono presentati un metodo per la produzione di LUV, insieme a combinazioni standard di proteine della famiglia BCL-2 e controlli per esaminare la permeabilizzazione delle LUV.
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Articolo metodologico
Esaminando BCL-2 Funzione Famiglia con grandi vescicole unilamellari
In questo articolo
Sommario
Abstract
La famiglia BCL-2 (B cell CLL/linfoma) è composta da circa venti proteine che collaborano per mantenere la sopravvivenza cellulare o avviare l'apoptosi1. In seguito a stress cellulare (ad es., danno al DNA), gli effettori pro-apoptotici della famiglia BCL-2, BAK (killer antagonista di BCL-2 1) e/o BAX (proteina associata a BCL-2 di tipo X), vengono attivati e compromettono l'integrità della membrana mitocondriale esterna (OMM), attraverso il processo noto come permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna (MOMP)1. Dopo che si verifica la MOMP, le proteine pro-apoptotiche (ad es., citocromo c) raggiungono il citoplasma, promuovono l'attivazione delle caspasi e l'apoptosi si verifica rapidamente2.
Affinché BAK/BAX inducano la MOMP, è necessario che interagiscano in modo transitorio con membri di un altro sottoinsieme pro-apoptotico della famiglia BCL-2, le proteine contenenti solo il dominio omologo a BCL-2 della regione 3 (BH3-only), come BID (agonista del dominio interagente con BH3)3-6. Le proteine anti-apoptotiche della famiglia BCL-2 (ad es. gene correlato a BCL-2, isoforma lunga, BCL-xL; leucemia mieloide 1, MCL-1) regolano la sopravvivenza cellulare controllando strettamente le interazioni tra BAK/BAX e le proteine BH3-only in grado di attivare direttamente BAK/BAX7,8. Inoltre, la disponibilità delle proteine anti-apoptotiche BCL-2 è regolata anche dalle proteine BH3-only sensibilizzatrici/de-repressori, come BAD (antagonista di BCL-2 della morte cellulare) o PUMA (modulatore dell'apoptosi upregolato da p53), che si legano e inibiscono i membri anti-apoptotici7,9. Poiché la maggior parte del repertorio di proteine anti-apoptotiche BCL-2 è localizzata nella membrana mitocondriale esterna (OMM), la decisione cellulare di mantenere la sopravvivenza o indurre la MOMP è determinata da molteplici interazioni della famiglia BCL-2 a livello di questa membrana.
Vesicole unilamellari grandi (LUV) sono un modello biochimico per esplorare le relazioni tra le interazioni della famiglia BCL-2 e la permeabilizzazione della membrana10. Le LUV sono costituite da lipidi definiti assemblati in rapporti identificati negli studi sulla composizione lipidica di mitocondri di Xenopus estratti con solvente (46,5% fosfatidilcolina, 28,5% fosfatidiletanolammina, 9% fosfatidilinositolo, 9% fosfatidilserina e 7% cardiolipina)10. Questo è un sistema modello conveniente per esplorare direttamente la funzione della famiglia delle proteine BCL-2, poiché le componenti proteiche e lipidiche sono completamente definite e gestibili, cosa che non sempre si verifica con i mitocondri primari. Sebbene il contenuto di cardiolipina non sia solitamente così elevato in tutta la membrana mitocondriale esterna (OMM), questo modello riproduce fedelmente l'OMM favorendo la funzione della famiglia BCL-2. Inoltre, una modifica più recente del protocollo sopra descritto consente analisi cinetiche delle interazioni proteiche e misurazioni in tempo reale della permeabilizzazione della membrana, basate su LUV contenenti un colorante policationico (ANTS: 8-aminonafталene-1,3,6-trisolfonico) e un quencher cationico (DPX: pbromuro di xilene-bis-piridinio11. Man mano che le LUV si permeabilizzano, ANTS e DPX si diffondono separatamente e viene rilevato un aumento della fluorescenza. Di seguito vengono descritte combinazioni comunemente utilizzate di proteine ricombinanti della famiglia BCL-2 e controlli impiegando LUV contenenti ANTS/DPX.
Protocollo
1. Combinare i lipidi e creare un film lipidico
- Operando in una cappa con illuminazione minima, i lipidi solubilizzati in cloroformio vengono combinati in un vial in vetro ambrato da 1,5 ml utilizzando una siringa in vetro ermetica per gas Hamilton risciacquata con cloroformio. Questa miscela produrrà circa 4 mg di lipidi (Figura 1A).
- Cardiolipina 10 mg/ml (CL) - 63 μl
- Fosfatidilcolina 10 mg/ml (PC) - 84 μl
- Fosfatidiletanolammina 10 mg/ml (PE) - 125 μl
- Fosfatidilinositolo 10 mg/ml (PI) - 59,5 μl
- Fosfatidilserina 10 mg/ml (PS) - 65 μl
- Per rimuovere il cloroformio, applicare un flusso delicato di un gas inerte (ad es., azoto o argon) nel vial. Un film lipidico diventerà visibile sul fondo e sui lati del vial una volta asciutto, il che richiede tipicamente da 2 a 3 ore (Figura 1A).
2. Preparare la soluzione di liposomi
- In provette microcentrifuga da 1,7 ml, preparare 500 μl di ANTS 12,5 mM nel buffer LUV (0,2 mM EDTA, 10 mM HEPES [pH 7], 200 mM KCl, 5 mM MgCl2 ) e 500 μl di DPX 45 mM nel buffer LUV (Figura 1B).
- Mescolare le soluzioni di ANTS e DPX, vortexare per 1 minuto e sottoporre a sonicazione per 1 minuto a temperatura ambiente. La sonicazione va eseguita in un bagno ad ultrasuoni (ad es. Branson 3510MTH, nessuna impostazione specifica, semplicemente acceso). Questo garantisce che le soluzioni siano completamente solubilizzate e omogenee.
- Aggiungere la soluzione di ANTS/DPX al film lipidico e sigillare la provetta con parafilm (Figura 1B).
- Sottoporre il film lipidico a sonicazione nel bagno d'acqua sopra descritto per 5 minuti. Dopo la sonicazione, la soluzione apparirà opalescente. Assicurarsi che il film lipidico sia completamente solubilizzato, poiché aggregati lipidici residui potrebbero compromettere i passaggi successivi. Verificare inoltre le pareti e il fondo della provetta per accertarsi che non rimanga alcun film lipidico (Figura 1B).
3. Estrusione e purificazione dei liposomi
- Assemblare l'estrusore seguendo le indicazioni del produttore, utilizzando il buffer LUV per inumidire i supporti del filtro e la membrana in policarbonato. Stringere la carcassa dell'unità in modo da evitare perdite di volume durante l'estruzione, ma senza stringere eccessivamente per non rompere la membrana. È anche consigliabile provare l'estrusore con il buffer LUV per assicurarsi che non ci siano perdite o problemi.
- Partire con la soluzione lipidica nella siringa di destra ed effettuare 31 passaggi della soluzione attraverso l'estrusore; alla fine le LUV si troveranno nella siringa di sinistra, garantendo che tutti i lipidi abbiano attraversato la membrana almeno una volta. Nei primi passaggi potrebbe essere necessaria una leggera pressione aggiuntiva per far passare la soluzione attraverso la membrana. Se la soluzione dovesse passare improvvisamente con facilità, verificare la presenza di rotture nella membrana e sostituirla, se necessario (Figura 1C).
- Preparare una colonna a flusso gravitazionale da 10 ml di Sepharose S-500 (1,0 cm x 20 cm, volume di perle pari a 10 ml). Lavare con 3 volumi di colonna di buffer LUV, lasciare che il flusso si arresti e chiudere con un tappo. Poiché questo passaggio richiede del tempo, è preferibile iniziare il lavaggio mentre i lipidi vengono essiccati. Mantenere la colonna chiusa fino al momento dell'uso.
- Aggiungere le LUV estruse alla colonna in un unico passaggio, evitando di disturbare l'interfaccia delle perle. Lasciare defluire il buffer dalla colonna, quindi arrestare il flusso e tappare. Riempire delicatamente la colonna con buffer LUV. Anche in questo caso, prestare attenzione durante l'aggiunta del buffer per non perturbare le perle (Figura 1C).
- Rimuovere il tappo e raccogliere 6 frazioni da 1 ml ciascuna. Le LUV eluiscono normalmente nelle frazioni 3 e 4 e possono essere identificate per l'aspetto torbido. Dopo aver raccolto le frazioni, lavare la colonna con 5 volumi di acqua e 2 volumi di etanolo al 20%. Conservare la colonna a 4 °C (Figura 1C).
- Conservare le frazioni a 4 °C al buio fino al momento dell'analisi.
4. Testare le frazioni della colonna
- Le frazioni della colonna vengono ora testate per la fluorescenza confrontando il buffer LUV con il buffer LUV integrato con lo 0,5% di CHAPS. Le frazioni che mostrano un aumento della fluorescenza in presenza di CHAPS contengono LUV. Pipettare 100 μl di buffer LUV o di buffer LUV + 0,5% CHAPS in sei pozzetti ciascuno e aggiungere 5 μl della frazione appropriata, quindi mescolare. Utilizzare piastre da 96 pozzetti opache, nere e non trattate per tutti gli studi sui LUV (Figura 1D).
- Leggere la piastra a 37 °C con i seguenti parametri: lunghezza d'onda di eccitazione: 355 nm; lunghezza d'onda di emissione: 520 nm; guadagno (tensione): 125; posizione ottica: superiore; altezza di lettura: 5,5 mm. Questa configurazione è specifica per il BioTek H1 Synergy con software Gen 5 2.0 (Figura 1D).
- Le frazioni 3 e 4 mostrano generalmente un aumento della fluorescenza da 5 a 10 volte. Dopo l'analisi, unire le frazioni contenenti LUV e conservarle a 4 °C al buio; verranno purificate circa 2 ml di lipidi a una concentrazione di ~ 2 mM (Figura 1D).
5. Studi sulla famiglia BCL-2 mediante LUV
- I proteine BCL-2 vengono testate per la loro capacità di indurre direttamente la permeabilizzazione delle LUV e per la regolazione dell'attività di permeabilizzazione. I saggi con LUV sono normalmente eseguiti in volumi di 100 μl, a 37 °C, e possono essere analizzati in un singolo punto temporale dopo 30 - 60 min (Figure 2A-C, 3A-B), oppure mediante studi cinetici ogni 1 - 2 min per un massimo di 1 ora (Figura 2D). Un esempio di progettazione del saggio che descrive componenti, concentrazioni stock/finali e ordine di aggiunta è riportato (Tabella 1). È inoltre consigliabile impostare il lettore di micropiastre in modo che agiti delicatamente la piastra prima di ogni lettura. I primi minuti spesso producono letture irregolari (probabilmente a causa di variazioni di temperatura, mescolamento, ecc.), pertanto in genere si considerano i dati ottenuti dopo 2 - 3 letture in uno studio cinetico. È inoltre comune osservare ampie barre di errore per alcune condizioni, a causa della variabilità tra diversi lotti di LUV e dell'efficienza delle interazioni proteiche a concentrazioni limite di attivazione o inibizione.
- Le soluzioni stock delle proteine della famiglia BCL-2 devono essere diluite nel buffer per LUV a una concentrazione 100x, e sono necessarie titolazioni di BAX, BID e di tutte le altre proteine per determinare le concentrazioni minime necessarie a rilevare una permeabilizzazione minima delle LUV dipendente da BAX in assenza di BID, nonché una sinergia significativa tra BAX e BID. Inoltre, tutte le altre proteine richiedono titolazioni per ridurre lo spreco proteico e minimizzare le concentrazioni degli aggiunti successivi.
6. Risultati rappresentativi
Esiste una miriade di opzioni per osservare ed esaminare la regolazione dipendente dalla famiglia BCL-2 della permeabilizzazione dei LUV. Per generare un controllo positivo di permeabilizzazione dei LUV, utilizziamo BAX attivato da detergente12. Il detergente, n-ottil-β-D-glucoside (OG), induce artificialmente l'attivazione di BAX (per 100 μl di OG-BAX 2,3 μM: 5 μg di BAX + 0,7% di OG nel buffer per LUV, incubare per 60 min a 4 °C, aliquotare e conservare a -80 °C); pertanto, OG-BAX (10 - 100 nM) può essere utilizzato come controllo positivo affidabile. È importante notare che concentrazioni di OG inferiori allo 0,025% non influenzano direttamente la permeabilizzazione dei LUV. Un trattamento con CHAPS allo 0,5% viene utilizzato per determinare la quantità massima di fluorescenza dei LUV per saggio, e questo valore rappresenta il 100%. Tutti i trattamenti devono essere allestiti in triplicato. Un esempio di allestimento del saggio di controllo con LUV è mostrato nella Tabella 1, e i dati corrispondenti sono presentati nella Figura 2A.
Un punto di partenza necessario per lo studio della permeabilizzazione dei LUV con le proteine della famiglia BCL-2 è stabilire le concentrazioni di BAX e BID in grado di promuovere un rilascio ottimale. Poiché diverse preparazioni proteiche mostreranno attività di permeabilizzazione di fondo differenti, è consigliabile effettuare una titolazione prima di impostare analisi più sofisticate. BAX (50 - 200 nM) e BID (0 - 10 nM) devono essere titolati per ottenere un rilascio di fondo minimo e una sinergia ottimale, come mostrato rispettivamente nelle Figure 2B-C. Diverse forme della proteina BID possono essere acquistate da R&D Systems; in alternativa, il peptide del dominio BH3 di BID è disponibile da Anaspec. Non esiste una forma commerciale di BAX adatta per saggi con LUV, pertanto deve essere espressa e purificata utilizzando metodi pubblicati3,13.
Una volta stabiliti le concentrazioni di BAX e BID e la loro sinergia, un saggio comune consiste nel determinare l'influenza delle proteine anti-apoptotiche sulla permeabilizzazione dei LUV mediata da BAX e BID. BCL-xL è un membro anti-apoptotico della famiglia BCL-2 disponibile in commercio, che inibisce in modo dose-dipendente l'attività di BAX e BID, solitamente in un intervallo di eccesso molare di 5 - 10 volte rispetto a BAX o BID (Figura 3A). Questo effetto inibitorio può essere invertito aggiungendo successivamente proteine BH3-only (con un eccesso molare di 2 - 5 volte rispetto a BCL-xL) o peptidi del dominio BH3 (con un eccesso molare di 5 - 10 volte rispetto a BCL-xL), che si legano a BCL-xL, permettendo così a BAX e BID di agire sinergicamente e permeabilizzare i LUV (Figura 3B). Nella Figura 3B, mostriamo l'effetto della proteina ricombinante umana PUMAβ a lunghezza intera, il cui peptido del dominio BH3 risulta funzionalmente simile (dati non mostrati)8. Questo esperimento è comunemente definito "saggio di de-repressione", poiché la proteina PUMA allevia l'effetto inibitorio di BCL-xL su BAX e BID. Idealmente, l'aggiunta della proteina o del peptide BH3-only de-reprimente dovrebbe avere effetti minimi sull'attivazione di BAX14.
Figura 1. (A) I lipidi solubilizzati in cloroformio vengono mescolati, essiccati per formare un film lipidico e quindi sigillati. (B) Le soluzioni di ANTS e DPX vengono preparate, unite e sottoposte a sonificazione per garantire una completa solubilizzazione e omogeneizzazione. La soluzione viene aggiunta al film lipidico, il vial viene sigillato con parafilm e sottoposto nuovamente a sonificazione per 5 min in un bagno d'acqua. A questo punto la soluzione apparirà opalescente. (C) La soluzione lipidica sonificata viene caricata nell'estrusore miniaturizzato, processata 31 volte e quindi aggiunta a una colonna preparata di Sepharose S-500 per la successiva purificazione. (D) Le frazioni ottenute dopo la cromatografia a esclusione molecolare vengono analizzate confrontando le unità fluorescenti relative (RFUs) nel buffer LUV e nel buffer LUV + 0,5% CHAPS. La lettura nel "buffer LUV" indica la fluorescenza di fondo in presenza di LUV integri; la condizione "buffer LUV + 0,5% CHAPS" mostrerà un aumento della fluorescenza indotto dalla lisi, indicativo della presenza di LUV. Le frazioni 3 e 4 contengono generalmente i LUV e vengono unite dopo l'analisi. Le frazioni 5 e 6 contengono ANTS non incorporato (ovvero, non contenuto all'interno dei LUV dopo l'estrusione), che mostrano un'elevata fluorescenza indipendentemente dal CHAPS. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.
Figura 2. Esperti di controllo della famiglia BCL-2 e titolazioni di BAX/BID utilizzando LUV. (A) Esperimenti di controllo. I LUV sono stati trattati con tampone per LUV soltanto, 0,025% octylglucoside "OG", 50 nM BAX o 50 nM OG-BAX. I LUV sono stati incubati per 60 min a 37 °C. La permeabilizzazione percentuale (%) è stata determinata sottraendo la fluorescenza del campione trattato con tampone da tutti gli altri campioni; la permeabilizzazione al 100% è stata determinata da un campione solubilizzato con 0,5% CHAPS; i valori sperimentali sono stati divisi per il valore CHAPS per ottenere la percentuale di permeabilizzazione dei LUV. OG-BAX è BAX attivata da detergente, che rappresenta un controllo positivo affidabile per la permeabilizzazione dei LUV. (B) Determinazione della concentrazione ottimale di BAX. I LUV sono stati trattati con concentrazioni crescenti di BAX (50 - 200 nM) in presenza di 10 nM C8-BID "BID" o tampone soltanto. (C) Determinazione della concentrazione ottimale di BID. I LUV sono stati trattati con concentrazioni crescenti di BID (0 - 10 nM) in presenza di 100 nM BAX. (D) Un esempio di un insieme di dati cinetici di permeabilizzazione dei LUV. I LUV sono stati trattati con BAX (100 nM) ± BID (10 nM). Le letture sono state effettuate ogni due minuti per 30 min, con due secondi di agitazione leggera della piastra prima di ogni lettura. Le prime tre letture (0, 2 e 4 min) non sono incluse nel grafico. I valori minimo e massimo di unità di fluorescenza relative (RFU) sono stati determinati come descritto nella sezione 4.3. Le barre di errore nelle Figure 2A-C rappresentano la deviazione standard di dati triplificati. I dati nella 2D rappresentano un saggio duplicato.
Figura 3. Esempi di comuni interazioni della famiglia BCL-2 studiate mediante l'uso di LUV. (A) La permeabilizzazione di LUV mediata da BAX e BID è inibita da BCL-xL. I LUV sono stati incubati con 100 nM di BAX, 10 nM di BID e concentrazioni crescenti di BCL-xL (0 - 500 nM). L'incubazione dei LUV è avvenuta per 60 min a 37 °C. (B) PUMA de-reprime BCL-xL, favorendo l'attività di BAX e BID. I LUV sono stati incubati con combinazioni di 100 nM di BAX, 10 nM di BID, 500 nM di BCL-xL e PUMA (0 - 2,5 μM) per 60 min a 37 °C. PUMA è stato utilizzato alla concentrazione di 2,5 μM anche in presenza di BAX da solo. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di dati ottenuti in triplicato.
| Ordine di aggiunta: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| CONDIZIONI | LUV Buffer | OG (0,7%) | BAX (2,3 μM) | OG-BAX (2,3 μM) | CHAPS (10%) | LUVs (2 mM) | TOTALE |
| Buffer | 95 μl | 5 μl | 100 μl | ||||
| OG (0,015%) | 92,83 μl | 2,17 μl | 5 μl | 100 μl | |||
| BAX (50 nM) | 92,83 μl | - | 2,17 μl | 5 μl | 100 μl | ||
| OG-BAX (50 nM) | 92,83 μl | 2,17 μl | 5 μl | 100 μl | |||
| CHAPS (0,5%) | 90 μl | 5 μl | 5 μl | 100 μl |
Tabella 1. Un esempio di saggio di controllo per determinare l'effetto di OG-BAX sulla permeabilizzazione delle LUV.
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Discussione
Il metodo descritto per la generazione di LUV consente un approccio rapido ed efficiente per testare la funzione di diverse proteine della famiglia BCL-2, peptidi e reagenti correlati in un ambiente di membrana biochimicamente definito simile alla MEO. Se si utilizzano valori finali per determinare la permeabilizzazione dei LUV, è possibile preparare diverse piastre per analizzare centinaia di condizioni entro una singola giornata. Riteniamo che i reagenti limitanti in questi saggi siano generalmente la qualità e la quan...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Desideriamo ringraziare tutti i membri del Chipuk Laboratory per la loro collaborazione e il sostegno. Inoltre, desideriamo esprimere il nostro apprezzamento a Tomomi Kuwana e Donald Newmeyer per aver sviluppato le basi sperimentali di questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto da: NIH CA157740 (a J.E.C.) e un progetto pilota dell'NIH P20AA017067 (a J.E.C.). Questo lavoro è stato inoltre sostenuto in parte da un contributo per la ricerca 5-FY11-74 della March of Dimes Foundation (a J.E.C.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph–thanolamine "PE" | Avanti | 850725C | |
| Fosfatidilcolina L-α (Uovo, Pollo) "PC" | Avanti | 840051C | |
| Fosfatidilinositolo L-α (Fegato, Bovino) "PI" | Avanti | 840042C | |
| Fosfatidilserina L-α (Cervello, Suino) "PS" | Avanti | 8400320 | |
| Cardiolipina (Cuore, Bovino - Sale di Sodio) "CL" | Avanti | 840012C | |
| Set miniestrusore | Avanti | 610023 | |
| Membrana PC 0,2 mM | Avanti | 610006 | |
| Piastra Costar nera a 96 pozzetti | Fisher Scientific | 07-200-590 | |
| BID umano scisso da caspasi-8 | R&D Systems | 882-B8-050 | |
| BCL-xL umano (senza estremità C-terminale) | R&D Systems | 894-BX-050 | |
| Peptidi dei domini BH3 di BID/PUMA | Anaspec | 61711/62404 | |
| Lettore microplacche ibrido multicanale Synergy H1 | BioTek | None |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
