Articolo metodologico

L'uso della microscopia Time lapse di visualizzare anossia indotta Suspended Animation in C. elegans Embrioni

DOI:

10.3791/4319

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3 dicembre 2012

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of North Texas

In questo articolo

Sommario

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Qui descritto è un In vivo Tecnica di immagine strutture subcellulari in animali esposti ad anossia utilizzando un flusso di gas attraverso la camera microincubation in congiunzione con un microscopio confocale disco rotante. Questo metodo è semplice e flessibile abbastanza per soddisfare una varietà di parametri sperimentali e sistemi modello.

Abstract

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Elegans Caenorhabdits è stato ampiamente utilizzato nello studio della resistenza alle sollecitazioni, che è facilitato dalla trasparenza degli stadi adulti ed embrioni nonché dalla disponibilità di mutanti genetici e ceppi transgenici che esprimono una miriade di proteine ​​di fusione 1-4. Inoltre, i processi dinamici come la divisione cellulare può essere visualizzato utilizzando proteine ​​del reporter fluorescente etichettati. Lo studio della mitosi può essere facilitata attraverso l'utilizzo di time-lapse esperimenti in vari sistemi, compresi gli organismi intatti e di conseguenza l'inizio C. embrione elegans è adatto per questo studio. Presentato qui è una tecnica con la quale immagini in vivo di strutture subcellulari in risposta a anossica (99.999% N 2; <2 ppm O 2) lo stress è possibile con un semplice flusso di gas attraverso la configurazione di un potente microscopio. Una camera microincubation viene utilizzato in combinazione con un flusso di azoto e gas attraverso un microscopio confocale disco rotanteper creare un ambiente controllato in cui gli animali possono essere esposte in vivo. Utilizzando GFP-tubulina gamma etichettato e istoni, la dinamica e arresto della divisione cellulare può essere monitorato prima, durante e dopo l'esposizione ad un ambiente privo di ossigeno. I risultati di questa tecnica sono ad alta risoluzione, video e immagini dettagliate delle strutture cellulari all'interno blastomeri di embrioni esposti a deprivazione di ossigeno.

Protocollo

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1. Preparazione del campione

  1. Produrre o ottenere adeguata transgenici C. elegans ceppo di interesse utilizzando metodologie transgeniche o da Caenorhabditis Genetica Image Center (CGC) o un collega. In questo caso stiamo usando ceppo TH32 (pie-1 :: TBG-1 :: GFP; pie-1 :: GFP :: H2B) 5 per visualizzare i cromosomi e centrosomi come marcatori per la divisione cellulare.
  2. Genera una popolazione sincronizzato utilizzando uno dei tre metodi: 1) si disintegrano adulti gravide in soluzione di ipoclorito e utilizzare gli embrioni restanti 6, 2) raccogliere adulti gravide su un piatto semi e farli posare emb....

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Risultati

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C. elegans embrioni esposti a grave carenza di ossigeno (anossia) sono in grado di sopravvivere con l'arresto di processi biologici tra cui lo sviluppo e la divisione cellulare 7. L'anossia arresto indotto di divisione cellulare può essere monitorata, ad un livello sub-cellulare, utilizzando una camera microincubation in combinazione con flusso di azoto e gas attraverso un microscopio confocale disco rotante per creare un ambiente controllato in cui gli animali possono essere esposte in vivo.......

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Discussione

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Privazione di ossigeno e Suspended Animation

Sebbene l'esposizione alla carenza di ossigeno grave può essere fatale per alcuni organismi, alcuni organismi sono in grado di sopravvivere l'esposizione a anossia. Nel caso di C. elegans, la sopravvivenza di esposizione anossia dipende stadio di sviluppo e la risposta alla anossia è entrata in uno stato di animazione sospesa reversibile in cui sono stati arrestati una serie di processi biologici osservabili. Processi di divisione ce.......

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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Vorremmo esprimere il nostro apprezzamento per l'ingresso e commenti dei membri del laboratorio Padilla. Ceppi di nematodi in questo lavoro sono stati forniti dalla genetica Caenorhabditis Center, che è finanziato dalla National NIH Center for Research (NCRR). Prendiamo atto e ringraziamo il Dott. Lon Turnbull per l'assistenza tecnica con la microscopia confocale. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Science Foundation (NSF-IOS, CARRIERA) per PAP

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti / Accessori Composizione
Soluzione di ipoclorito di 0,7 g KOH, 12 ml NaOCl 5%, portare a 50 ml con DDH 2 0
M9 tampone 3 g KH 2 PO 4, 11 g di Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO 4 per 1 L DDH 2 O
Vetro microscopio diapositive Fisher Scientific 12-550-343 3 "x1" x1.0 millimetro
Turno micro coprioggetti Scienze della microscopia elettronica 72223-01 25 mm Diametro
Halocarbon olio 700 Sigma H8898-100ml
Anestetico 0,5% TricAine, 0,05% Tetramisole
Leiden chiuso perfusione Microincubator Harvard Apparatus 650041
UHP azoto Calgaz (Air Liquide) > 99,9990% N 2 <2 ppm O 2
Tubo in plastica VWR 89068-468 0,062 "ID x 0.125" OD
Spinning microscopio confocale disco McBain Sistemi Zeiss microscopio ottico invertito, sistema di illuminazione epifluorescenza, CSU-10 Yokogawa scanner confocale, Hamamatsu moltiplicatore elettronico CCD.

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
  2. Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11<....

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Configurazione del flusso di gasmicroscopio confocale a disco rotantecamera di microincubazionegamma tubulina marcata con GFPdinamica degli istoniarresto del ciclo cellulareambiente privato di ossigeno

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