Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari

Sommario

Descriviamo l'isolamento rapido di primarie murine di tipo II le cellule epiteliali alveolari (AECII) per selezione di citometria di flusso negativo. Questi AECII mostrano alta vitalità e purezza e sono adatte per una vasta gamma di studi funzionali e molecolari riguardanti il ​​loro ruolo in condizioni respiratorie come le malattie autoimmuni o infettive.

Abstract

Durante gli ultimi anni, il contributo delle cellule alveolari di tipo II epiteliali (AECII) a vari aspetti della regolazione immunitaria nel polmone è stato sempre più riconosciuto. AECII hanno dimostrato di partecipare alla produzione di citochine in vie aeree infiammate ed agire anche come cellule presentanti l'antigene sia infezione e cellule T mediata autoimmunità ^1-8. Pertanto, essi sono particolarmente interessanti anche in contesti clinici, quali vie aeree iper-reattività estera e di auto-antigeni così come le infezioni che direttamente o indirettamente si rivolgono AECII. Tuttavia, la nostra comprensione delle funzioni immunologiche dettagliate serviti da cellule alveolari di tipo II epiteliali nel polmone sano così come in infiammazione rimane frammentario. Molti studi in materia di funzione AECII vengono eseguite utilizzando il mouse o umani linee cellulari epiteliali alveolari ^9-12. Lavorando con linee cellulari offre sicuramente una serie di vantaggi, come la disponibilità di grandi numeri of cellule per analisi approfondite. Tuttavia, riteniamo che l'uso di primaria AECII murino permette una migliore comprensione del ruolo di questo tipo di cellule in processi complessi come infezione o infiammazione autoimmune. Primaria AECII murino possono essere isolati direttamente da animali affetti da tali disturbi respiratori, nel senso che sono stati sottoposti a tutti gli altri fattori estrinseci che giocano un ruolo nel contesto analizzato. Come esempio, AECII vitali possono essere isolate da topi infettati intranasale con virus influenzale A, che colpisce principalmente queste cellule per la replicazione ^13. È importante sottolineare che, attraverso l'infezione ex vivo di AECII isolati da topi sani, gli studi sulle risposte cellulari montati su di infezione può essere ulteriormente estesa.

Nostro protocollo per l'isolamento di primaria AECII murino si basa sulla digestione enzimatica del polmone topo seguita da etichettare la sospensione cellulare risultante con anticorpi specifici per CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 e CD16/CD32. AECII granulari vengono identificate come la dispersione non marcato e lateralmente alta (SSC ^alta) popolazione cellulare e sono separati da fluorescenza activated cell smistamento ^3.

In confronto ai metodi alternativi di isolare cellule epiteliali primarie da polmoni di topo, il nostro protocollo per l'isolamento di citometria a flusso AECII per selezione negativa produce intatta, altamente puro AECII vitale e in tempi relativamente brevi. Inoltre, e in contrasto con i metodi convenzionali di isolamento di panning e deplezione dei linfociti tramite legame di anticorpo-accoppiati biglie magnetiche ^{14, 15,} citometria a flusso di cellule ordinamento consente discriminazione attraverso dimensione cellulare e granularità. Dato che la strumentazione per selezione cellulare citofluorimetrica è disponibile, la procedura descritta può essere applicata a costi relativamente bassi. Accanto a anticorpi standard e enzimi per la disintegrazione del polmone, senza reagenti aggiuntivi, come magneticoperline sono richiesti. Le cellule isolate sono adatti per un'ampia gamma di studi funzionali e molecolari, che comprendono la coltura in vitro di cellule T e saggi di stimolazione così come trascrittoma, proteoma o analisi secretoma ^{3, 4.}

Protocollo

Dettagli relativi reagenti e materiali necessari sono elencati nella tabella alla fine del protocollo di seguito. Prima di iniziare il lavoro, preparare 15 ml provette (uno per topo) contenente 4 ml di dispasi e pre-riscaldare a 37 ° C in un bagno d'acqua. In un blocco riscaldante, poco riscaldare piccole aliquote di 1% agarosio a bassa fusione (in acqua) a 95 ° C fino liquefatto e poi raffreddare a 45 ° C fino all'utilizzo.

1. Preparazione del polmone mouse

1. Sacrifica il mouse CO ₂ asfissia. Nota: Non eseguire dislocazione cervicale come questo danneggerà la trachea affinché seguendo fasi del protocollo, come l'installazione del polmone di liquido, non può essere eseguita con successo. Garantire perdita dei riflessi nocicettivi.
2. Spruzzare il mouse con etanolo e fare un taglio lungo la linea mediana ventrale del corpo. Tirare il pelo e la pelle ventrale e, successivamente, anche con attenzione tagliare e rimuovere il peritoneo.
3. Exsanguinate l'topo tagliando la vena giugulare sinistra e destra (Vena jugularis) e l'arteria renale (renalis Arteria). Rimuovere il sangue che scorre con il tessuto.
4. Attenzione puntura e rimuovere il diaframma per esporre il cuore e polmone tagliando via le costole. Fare attenzione a non danneggiare il polmone.
5. Con una cannula 26G e una siringa da 10 ml riempita con fosfato fredda tamponata (PBS), forare il ventricolo destro del cuore e la perfusione polmonare con PBS fino libera di sangue.
6. Tagliare e rimuovere le ghiandole salivari per esporre la trachea. Anche tagliare con cautela il muscolo che circonda la trachea.
7. Inserire una cannula 22G inabitazione nella trachea, rimuovere l'ago e spingere il catetere di plastica verso il polmone. Fissare il catetere legando un piccolo pezzo di filo intorno trachea e il catetere.

2. La digestione enzimatica del tessuto polmonare

Se desiderato, un campione di liquido di lavaggio broncoalveolare può esserepreparato dal lavaggio dei polmoni attraverso il catetere inserito nella trachea con PBS o mezzo prima del passaggio successivo.

1. Utilizzando una siringa da 2 ml, accuratamente infondere un volume massimo di 2 ml di dispasi (dal aliquota 4 ml) nel polmone attraverso il catetere in modo che tutti i lobi sono completamente espanso. Scambiare la siringa con una siringa da 1 ml contenente 0,5 ml di agarosio liquefatto e anche instillare nel polmone.
2. Lasciare la siringa sul catetere per evitare il riflusso del agarosio e coprire immediatamente il polmone con carta velina laboratorio e ghiaccio. Lascia il gel di agarosio per un paio di minuti.
3. Rimuovere la carta velina, ghiaccio, siringa e catetere, tagliare la trachea e le accise il cuore, polmone e del timo dal petto. Risciacquare il polmone in un piatto con PBS e rimuovere il, timo cuore e trachea rimanente.
4. Mettere il polmone nelle restanti 2 ml di dispasi e incubare a temperatura ambiente per 45 min.

3. Preparazione del polmoneSospensione cellulare

1. Rimuovere il polmone dal dispasi e trasferirlo in un piatto contenente 7 ml di anticorpo anti-CD16/32 (1 ug / ml concentrazione finale) in DMEM e 100 microlitri DNasi.
2. Utilizzando pinze, completamente disintegrare il tessuto polmonare tirandolo a parte e incubare per 10 min a temperatura ambiente mentre agitando lentamente su un agitatore impostato a 200 rpm. Se desiderato, la sospensione cellulare può essere conservato a 4 ° C fino alla fase successiva.
3. Filtrare la sospensione cellulare attraverso maglie nylon prima con 100 micron e successivamente con 70 pm, 48 pm e 30 micron pori. Prendono cura di risciacquare ogni maglia nonché i tubi e piatti accuratamente con DMEM per minimizzare la perdita di cellule e massimizzare la resa. Se in comune tutti i campioni, questo può essere realizzato da qui passando successivamente sospensioni cellule da topi di un gruppo attraverso lo stesso filtro. Sostituire il filtro in caso di intasamento.
4. A seconda del volume, trasferire il filtrato a uno o più provette da 50 ml ecentrifugare per 15 minuti a 160 xg e 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
5. Risospendere il pellet di cellule in 2 ml di tampone di lisi degli eritrociti (0,15 M NH ₄ Cl, 0,01 M KHCO _3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) e rapidamente terminare lisi mediante aggiunta di 13 ml di terreno DMEM. Trasferire la soluzione in un tubo da 15 ml e centrifugare per 12 min a 160 xg e 4 ° C.

4. Colorazione anticorpi per citometria a flusso Cell-ordinamento

1. Risospendere le cellule in 3 ml di cocktail di anticorpi primari, preparati in DMEM a diluizioni adatte per citometria a flusso. (Anticorpi precedentemente titolata per diluizioni ottimali di lavoro colorando 1 x 10 ⁶ splenociti in un volume di 100 pl. Uso 3 ml di cocktail anticorpo primario contenente le concentrazioni ottimali per ciascuno degli anticorpi utilizzati per le celle pool da cinque topi. Se più topi sono raggruppati per un campione, regolare il volume).
2. Per la colorazione, incubare le cellule per 10 minuti al buioa 4 ° C.
3. Lavare le cellule riempiendo il tubo 15 ml di DMEM e centrifugazione per 12 min a 160 xg e 4 ° C.
4. Nel caso in cui gli anticorpi disaccoppiati o biotinilato sono stati utilizzati in 4.1: Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 2-3 ml cocktail di anticorpi secondari. Colorazione per 10 min a 4 ° C al buio.
5. Lavare le cellule attraverso il tubo di riempimento con DMEM e centrifugazione per 12 min a 160 xg e 4 ° C.
6. Risospendere le cellule in 1 ml di DMEM e pre-filtro attraverso un filtro 50 micron in un tubo per cellula-ordinamento. Opzionale: Contare le cellule per ottenere il numero totale delle cellule in sospensione di cellule del polmone.

5. Cell-ordinamento

1. Mescolare le cellule nel vortex prima cernita. Utilizzare un ugello 100 micron per la cella-cernita dei AECII. Pressione del fluido guaina nonché emissione laser e lunghezze d'onda di rilevamento dipendono strumento utilizzato per citometria a flusso di cellule ordinamento nonché i fluorocromi usati nella antibody colorazione procedura.
2. Porta sulle cellule SSC ^alti che sono negativi per i fluorocromi utilizzati per la colorazione e l'ordinamento in una provetta contenente DMEM. Utilizzare in avanti altezza scatter (FSC-H) vs area (FSC-A) e l'altezza dispersione laterale (SSC-H) vs area (SSC-A) di Windows per escludere eventuali doppiette o aggregati cellulari (vedi dettagli della strategia di gating in Figura 1 a).
3. Per raccogliere la centrifuga ordinati cellule per 20 minuti a 280 xg e 4 ° C.
4. Risospendere le cellule in coltura-medio o tampone come richiesto per la successiva analisi.

Risultati

Quando si ordina sospensioni di cellule polmonari isolati da topi sani, il cancello AECII in genere rappresentano circa il 42 ± 10% di tutti gli eventi. Tale percentuale può essere notevolmente inferiore quando topi con patologie respiratorie come una infezione virale vengono utilizzati, come la sospensione cellulare iniziale conterrà una percentuale notevolmente più elevata di linfociti e di altre cellule immunitarie reclutati per le vie respiratorie. Per AECII isolata da polmoni IAV infetti al giorno 3 dopo l'infe...

Discussione

Nostro protocollo per l'isolamento di AECII murino mediante citometria a flusso offre un modo rapido di accedere cellule primarie del polmone mouse per tutta una serie di studi funzionali e molecolari. La procedura descritta produce popolazioni altamente vitali e puro di AECII che sono in numero sufficiente per le successive analisi dirette, come l'RNA isolamento (vedi figura 2b) e studi del trascrittoma. Per applicazioni funzionali, è anche possibile per coltivare le cellule isolate, consentend...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
inabitazione cannula Introcan 22G	Braun	REF 4252098B
Dispasi, 100 ml (5000 unità caseinolytic)	BD Biosciences	354235	aliquota da 4 ml in provette da 15 ml, conservare a -20 ° C
Biozym placca agarosio	Biozym	840101	1% w / v in H 2 O
Deoxyribonuclease I da pancreas bovino, 2000 unità Kunitz / flaconcino	Sigma-Aldrich	D4263	fresco Sciogliere il contenuto di 1 fiala in 300 ml DMEM
DMEM	Gibco	22320-022	utilizzato secondo quanto previsto dal costruttore (Low Glucose, piruvato, HEPES)
filtri cellulari (100 micron, 75 micron)	BD Falcon	352360, 352350
maglia di nylon (48 micron, 30 micron)	Buckmann GmbH	03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 um filtro	PARTEC	04-0042-2317
anti-topo CD16/CD32	BioLegend	101302	clone 93; purificato
anti-topo F4/80	BioLegend	123116	clone BM8; APC accoppiato
anti-topo CD11b	BioLegend	101208	clone M1/70; PE accoppiato
anti-topo CD11c	BioLegend	117310	clone N418; APC accoppiato
anti-topoCD45	BioLegend	103102	clone 30-F11; purificato
anti-topo CD19	eBioscience	12-0193-83	EBIO 1D3; PE accoppiato
policlonale di capra anti-topo IgG	BD Pharmingen	550767	policlonale, PE accoppiato
			Anticorpi accoppiati a fluorocromi alternativi possono essere utilizzati, a seconda del citofluorimetro e laser disponibili.