Perfusione intravascolare di inchiostro nero di carbonio permette la visualizzazione affidabile dei vasi cerebrali

Mohammad R. Hasan; Josephine Herz; Dirk M. Hermann; Thorsten R. Doeppner

doi:10.3791/4374

Articolo metodologico

Perfusione intravascolare di inchiostro nero di carbonio permette la visualizzazione affidabile dei vasi cerebrali

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DOI:

10.3791/4374

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4 gennaio 2013

Mohammad R. Hasan¹ , Josephine Herz¹ , Dirk M. Hermann¹ , Thorsten R. Doeppner¹

¹Department of Neurology, University of Duisburg-Essen Medical School

In questo articolo

Sommario

Analisi di anatomia roditore cerebrovascolari svolge un ruolo importante nella ricerca sperimentale ictus. In questo contesto, la perfusione intravascolare con lattice colorato è stato considerato come uno strumento standard per diversi anni. Tuttavia, questa tecnica comporta diverse limitazioni tecniche che mettono a repentaglio la sua riproducibilità. Qui, descriviamo un metodo semplice per visualizzare i vasi cerebrali in modo riproducibile. Iniezione di una miscela di due inchiostri carbon black commercialmente disponibili attraverso i risultati ventricolo sinistro del miocardio nel riempimento adeguato dei vasi cerebrali con visualizzazione ad alto contrasto. Abbiamo applicato con successo questa tecnica per identificare i punti di anastomosi tra territori vascolari cerebrali di topi con diversi background genetici. Abbiamo finalmente le prove che questo nuovo metodo e semplice per la colorazione del serbatoio può essere combinato con cloruro di trifeniltetrazolio (TTC) colorazione - uno strumento ampiamente utilizzato per osservare e analizzare i volumi di infarto nei topi.

Abstract

La struttura anatomica dei vasi cerebrali è un fattore determinante per l'emodinamica del cervello così come la gravità delle lesioni in seguito insulti ischemici. Vascolarizzazione cerebrale risponde dinamicamente ai diversi stati patofisiologici e presenta notevoli differenze tra i ceppi e in condizioni di manipolazioni genetiche. Essenzialmente, una tecnica affidabile per la colorazione di vasi intracranici è essenziale per studiare la patogenesi di ictus ischemico. Fino a poco tempo, un insieme di tecniche diverse è stato impiegato per visualizzare la vascolarizzazione cerebrale compresa l'iniezione di resina a bassa viscosità, Araldite F, gelatina miscelato con coloranti vari ¹ (cioè rosso carminio, India inchiostro) o lattice con ² o ³ senza nerofumo. Perfusione del bianco composizione di lattice attraverso l'aorta ascendente è stata riportata da Coyle e Jokelainen ^3. Maeda et al. ² hanno modificato il protocollo con l'aggiunta di carbon inchiostro nero per la composizione di lattice per la visualizzazione migliore contrasto delle navi dopo perfusione fisiologica del cervello. Tuttavia, perfusione inefficiente e inadeguato riempimento dei vasi sono spesso sperimentata a causa della elevata viscosità del composto lattice ^4. Pertanto, abbiamo descritto una tecnica semplice ed efficace utilizzando una miscela di due inchiostri neri di carbonio disponibili in commercio (CB1 e CB2) per visualizzare la vascolarizzazione cerebrale in modo riproducibile ^5. Abbiamo dimostrato che la perfusione con CB1 CB2 + in topi risultati in colorazione significativamente più piccoli vasi cerebrali ad una densità maggiore rispetto alla perfusione lattice ^5. Qui, descriviamo il nostro protocollo di individuare i punti di anastomosi tra la parte anteriore (ACA) e medio arterie cerebrali (MCA) per studiare le variazioni delle navi nei topi con differenti background genetici. Infine, abbiamo dimostrato la fattibilità della nostra tecnica in un modello transitoria ischemia cerebrale focale in topi combinando CB1 +CB2-mediata colorazione vaso con colorazione TTC in vari gradi di lesioni ischemiche.

Protocollo

1. Animali

Gli esperimenti sono stati effettuati secondo le linee guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvato dalle autorità locali. Per tutti gli esperimenti, C57Bl6 / J sorci di tipo selvatico, ApolipoproteinE ^{- / -} (ApoE KO) e SV129 topi (12-16 settimane, 26-30 g di peso corporeo, 5-6 animali per gruppo sperimentale) sono stati utilizzati.

2. La colorazione dei vasi cerebrali con lattice colorato

Preparare una miscela di 25 pl di inchiostro nero di carbonio (Herlitz, Germania) con 0,5 ml della composizione di lattice (Pebeo, Francia) in un rapporto di 1:20 in una provetta EP e scaldare la miscela a 37 ° C in un bagno d'acqua. Raccogliere il composto in una siringa 2 ml con un ago di 28-30G prima anestetizzante l'animale.
Sciogliere 50 mg di polvere cloridrato papavarine in 1 ml di soluzione fisiologica sterile. Raccogliere la soluzione in una siringa da insulina. Rompere l'ago da un'altra siringa da insulina sterile. Posizionare questo ago al termine di un 20 cm PE10 tubo. Ora attaccate questo tubo PE10 sull'ago della siringa contenente insulina soluzione papavarine cloridrato essere iniettato attraverso la vena femorale per garantire vasodilatazione e corretto riempimento dei vasi.
Preparare altri due siringhe da insulina ciascuna contenente 1 ml di soluzione fisiologica. Siringhe da insulina consentono una regolare erogazione del fluido iniettato in una posizione precisa. Tuttavia, a causa della elevata viscosità del lattice, alternativa 1 ml siringhe con aghi rimovibili ampia dovrebbero essere usati.
Prendere tutte le siringhe e strumenti sterilizzati dissezione vicino alla fase operativa. Stendere un foglio chirurgica mercante di stoffe intorno la fase di esercizio. La fase di esercizio deve essere sufficientemente illuminata e un microscopio operativo possono essere utilizzati, se necessario.
Ora misurare il peso corporeo di un C57Bl6 / J mouse e quindi indurre anestesia con isoflurano vaporizzato 5% in 70% N ₂ O e 30% O _2. Continua l'anestesia con 1% di isoflurano vaporizzato. Dopo POSIZIONAM correttag del mouse sul dorso e la fissazione degli arti, valutare la profondità dell'anestesia. Poi tagliare la pelle sopra la vena femorale sinistra e localizzare la vena. Inserire la punta affilata dell'ago posto sulla PE10 tubo e iniettare lentamente papavarine cloridrato soluzione ad una velocità di 100 pl per min (50 mg / kg di peso corporeo).
Dopo l'iniezione, tagliare la cavità addominale e perforare la membrana. Tagliare le costole per esporre il cuore senza danneggiare o lividi esso. Agganciare l'aorta toracica discendente con una pinza arterie. Fare un taglio netto sopra l'atrio destro per consentire al sangue venoso defluire. Iniettare 2 ml di soluzione fisiologica nel ventricolo sinistro, seguita iniettando il lattice colorato manualmente con una leggera pressione sul 18-20 sec. Utilizzare le siringhe pre-riempite uno dopo l'altro. Evitare di iniettare eventuali bolle.
Dopo iniezione di lattice, lasciare l'animale per 5 min. Decapitare l'animale e rimuovere con attenzione l'intero cervello. Abbiate cura di non danneggiare l'architettura navale e cortex Durante la rimozione dell'osso del cranio e meningi. Mettere il cervello in un piatto cella 60 millimetri di coltura contenente 6-8 ml del 4% PFA per scattare una foto. Posizionare un righello di misura sotto il piatto trasparente. Scatta foto con un ingrandimento 25x della dorsale e la superficie ventrale del cervello con una macchina fotografica collegata al microscopio operatorio. Le foto devono essere prese a un angolo di 90 ° tra la piastra di Petri e l'obiettivo microscopio al fine di quantificare la distanza originale.
Ripetere la procedura in altri animali 4-5.

3. La colorazione dei vasi cerebrali con miscela di inchiostri nero di carbonio

Per confrontare il risultato di lattice a base colorazione vascolare cerebrale con il nostro protocollo, preparare una miscela di 100 pl di Herlitz Stempelfarbe inchiostro (CB1) con 900 microlitri di Pelican Scribtol Schwarz inchiostro (CB2) in una provetta da 1,5 ml EP. Preparare due tubi PE per fare un volume totale di 2 ml della miscela CB1 e CB2 in un rapporto 1:9. Raccogliere il composto in due siringhe da insulina separate (1ml ciascuna). Tappare le siringhe e metterli in un bagno d'acqua per riscaldare fino a 37 ° C. Raccogliere 2 ml di soluzione fisiologica in altri due siringhe da insulina, e metterli in un bagno di acqua come bene.
Anestetizzare l'animale e ripetere la stessa procedura descritta sopra, eccetto per iniezione di cloridrato papavarine. Dopo iniezione di 2 ml salaine nel ventricolo sinistro, iniettare una miscela di 2 ml di inchiostri nero di carbonio invece del lattice colorato. Eseguire le iniezioni a mano con una leggera pressione sul 18-20 sec per ml. Agganciare l'aorta toracica discendente prima delle iniezioni.
Sacrificio l'animale, rimuovere il cervello e prendere le foto.
Per conservazione a lungo termine del cervello, mettere il cervello in 4% PFA overnight seguita da incubazione con saccarosio con concentrazione aumenta gradualmente fino a quando il cervello galleggiante sommerge totalmente (5% seguito da 15% e 30%). Cervelli degli animali perfusi con il lattice colorato può essere conservato nello stesso modo.
Eseguire laprocedura in un altro 4-5 animali. Per confrontare la differenza di anatomia vascolare cerebrale a causa di differenti background genetico o ceppi, ripetere il protocollo in numero uguale di ApoE KO e SV129 topi, rispettivamente.
Per studiare l'anatomia vascolare in condizioni ischemiche, inducono transitoria ischemia cerebrale focale per 45 min o 90 min secondo un protocollo standard di occlusione intraluminale del MCA sotto anestesia profonda (una descrizione dettagliata della chirurgia è oltre la portata di questo articolo, la si rimanda a Doeppner et al., 2010). Al termine del periodo di riperfusione programmato (1 giorno o 5 giorni), eseguire la colorazione vascolare con + CB1 CB2 solo gli inchiostri e macchiare l'intero cervello con 2% di soluzione di TTC a 37 ° C per 5-10 minuti per identificare il volume dell'infarto . TTC è ridotto a formazano rosso colorato dagli enzimi mitocondriali (succinato deidrogenasi in particolare). Dopo la colorazione TTC, le macchie dei tessuti metabolicamente attivi profondo rosso, mentre il tessuto infartuato rimane unstaiNed e appare bianca a causa di disfunzioni e denaturato enzima mitocondriale. Raccogliere immagini nello stesso modo come sopra descritto.

4. Studio dei territori vascolari cerebrali

Per analizzare l'anatomia dei vasi cerebrali, immagini della superficie dorsale del cervello sia macchiata di colore lattice o CB1 + CB2 inchiostri possono essere analizzati con il software ImageJ (un software basato su Java di dominio pubblico utilizzato per l'elaborazione delle immagini e l'analisi). I cervelli perfusi con il lattice di colore può mostrare gradi variabili di colorazione nave si trova sulla superficie dorsale, mentre CB1 + CB2 perfusione si macchia tutti gli arredi su entrambe le superfici ventrale e dorsale.
Aprire un file di immagine con il software ImageJ. Identificare tutti i punti anastomotiche tra l'ACA e la MCA. Un punto anastomotico viene definito come il sito in cui il diametro del vaso è più stretta o la distanza tra il mezzo più vicini punti di ramificazione della ACA ei rami MCA, rispettivamente ^2. ^{Disegnare una linea immaginaria (anastomosi linea) segnando i punti anastomotiche con l'aiuto di strumento di disegno linea segmentata e il plugin "Linea tratteggiata".}
Impostare la scala in mm. Misurare la distanza tra la linea di anastomosi e la linea mediana a 4 mm caudalmente al polo frontale del cervello utilizzando retta strumento di disegno linee e strumento di "misura". Fate lo stesso a 6 mm caudalmente dal polo frontale. Analizzare le immagini 3-4 per animale e calcolare il valore medio. Confrontare i valori tra i diversi gruppi di animali per identificare la variazione di anatomia cerebrovascolare. In C57Bl6 / J animali, la linea anastomotica tra ACA e l'MCA può essere fatta più vicino alla linea mediana a 4 mm rispetto a 6 mm caudalmente dal polo frontale. ApoE topi KO presenterà alcuna differenza significativa in questo senso. Al contrario, in topi SV129 linea anastomotica giacerà millimetri ulteriormente e parallelamente alla linea mediana sia a 4 mm e 6 caudalmente dal polo frontale.
Per analizzare l'anatomia vascolare in condizioni di ischemia, eseguire gli stessi calcoli di cui sopra. Identificare il confine infarto come il bordo rosso e bianco velina colorata che rappresenta un tessuto metabolicamente attivo e tessuto necrotico senza macchia, rispettivamente. Misurare la distanza del bordo infarto dalla linea mediana a 4 mm e di 6 mm caudale dal polo frontale del cervello. Raccogliere il valore medio a partire da immagini 3-4 per animale. Confrontare i risultati tra ischemia diverso e periodi di riperfusione.