RNA-seq Analisi trascrittomi in trombina-trattati e di controllo dell'uomo polmonari cellule endoteliali microvascolari

Summary

Questo protocollo presenta una procedura completa e dettagliata di applicare RNA-seq, una potente tecnologia di nuova generazione di sequenziamento del DNA, per trascrittomi profilo in umano cellule endoteliali microvascolari polmonari con o senza trattamento trombina. Questo protocollo è generalizzabile a varie cellule o tessuti colpiti da diversi reagenti o stati di malattia.

Abstract

La caratterizzazione di espressione genica in cellule attraverso la misurazione dei livelli di mRNA è uno strumento utile nel determinare come la macchina di trascrizione della cellula è influenzata da segnali esterni (per esempio trattamento di droga), o come cellule differiscono tra uno stato di salute e di uno stato di malattia. Con l'avvento e il perfezionamento continuo della prossima generazione di tecnologia di sequenziamento del DNA, RNA-sequenziamento (RNA-seq) è diventato un metodo sempre più popolare di analisi del trascrittoma di catalogare tutte le specie di trascrizioni, per determinare la struttura della trascrizione di tutti i geni espressi e di quantificare i livelli di espressione di cambiamento del set totale di trascritti in un dato ^1,2 cellula, tessuto o organismo. RNA-seq sostituisce progressivamente DNA microarrays come metodo preferito per l'analisi del trascrittoma perché ha i vantaggi di una profilatura transcriptome completa, fornendo un tipo di dato digitale (numero di copie di ogni trascrizione) e non basandosi su qualsiasi sequen genomica notace ^3.

Qui vi presentiamo un protocollo completo e dettagliato di applicare RNA-seq per trascrittomi profilo in umano cellule endoteliali microvascolari polmonari con o senza trattamento trombina. Questo protocollo si basa sul nostro recente studio pubblicato dal titolo "RNA-Seq rivela trascrittoma Romanzo di geni e loro isoforme umane in cellule endoteliali microvascolari polmonari trattati con trombina," ⁴ in cui abbiamo effettuato con successo la prima analisi completa del trascrittoma umane polmonari cellule endoteliali microvascolari trattate con trombina utilizzando RNA-seq. Ha prodotto le risorse senza precedenti per la sperimentazione ulteriore di acquisire conoscenze sui meccanismi molecolari alla base di trombina-mediata disfunzione endoteliale nella patogenesi di condizioni infiammatorie, il cancro, il diabete e le malattie cardiache coronariche, e fornisce nuovi indizi per potenziali bersagli terapeutici per queste malattie.

Il testo descrittivo di questo protocolloè diviso in quattro parti. La prima parte descrive il trattamento di polmonari umane cellule endoteliali microvascolari con trombina e isolamento dell'RNA, analisi della qualità e quantificazione. La seconda parte descrive la costruzione della libreria e sequenziamento. La terza parte descrive l'analisi dei dati. La quarta parte descrive una RT-PCR convalida. I risultati rappresentativi di diversi passaggi chiave vengono visualizzati. Consigli utili o precauzioni per aumentare il successo in passaggi chiave sono forniti nella sezione di discussione. Sebbene questo protocollo utilizza polmonari umane cellule endoteliali microvascolari trattate con trombina, può essere generalizzato a trascrittomi profilo sia nelle cellule di mammiferi e non mammiferi e nei tessuti trattati con differenti stimoli o inibitori, o per confrontare trascrittomi in cellule o tessuti tra uno stato di salute e uno stato di malattia.

Protocol

Un diagramma di flusso che illustra questo protocollo è mostrato in Figura 1.

1. Il trattamento delle cellule con la trombina, l'RNA Isolation, della Qualità e di quantificazione di RNA

1. La cultura umana del polmone cellule endoteliali microvascolari (HMVEC-LBL) al 90-100% confluenza in piastre da 6 pozzetti in EGM-2 media al 5% di FBS, fattori di crescita e gli antibiotici (Lonza, cat # CC-3202).
2. Cambiare supporto ai media fame (0% FBS) 30 minuti prima del trattamento con trombina.
3. Trattare le cellule con 0,05 U / ml di trombina o lasciato non trattato come un controllo per 6 ore a 37....

Results

Per Fase 1: Il 28s: 18s rapporto è tradizionalmente utilizzato come indicatore di degradazione dell'RNA. Idealmente, il picco 28s dovrebbe avere circa due volte l'area della banda 18s (un rapporto di 2), tuttavia questo rapporto ideale spesso non viene osservata nella pratica. Inoltre, 28s: 18s rapporti ottenuti da metodi spettrofotometrici può sottovalutare la quantità di degradazione dell'RNA. Per quantificare più accuratamente la degradazione, e quindi la qualità del campione RNA, il sistema calcola .......

Discussion

Passaggi chiave

Manipolazione di RNA: RNasi peggiora anche i più di alta qualità RNA, pertanto è necessario prestare attenzione durante l'isolamento, lo stoccaggio e l'uso di RNA ^10. I guanti sono sempre indossati per prevenire la contaminazione da RNasi presenti sulle mani umane. I guanti devono essere cambiati spesso, in particolare dopo la pelle toccare, maniglie delle porte o altre superfici comuni. Una serie di pipette deve essere dedicato esclusivamente.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenti o Attrezzature	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Umani del polmone cellule endoteliali microvascolari	Lonza	CC-2815
Lonza, Kit proiettile	Lonza	CC-3202	Contiene EGM-2, FBS, fattori di crescita e antibiotici
Trombina	Sigma	T4393
Ambion mir Vana Kit	Life Technologies	AM 1560
RNase-Zap	Life Technologies	AM9782
Experion StdSens RNA	Bio-Rad	700-7103
TruSeq RNA PreparazioneKit	Illumina	FC-122-1001
AMPureXP Perline	Beckman Coulter	A63881
Superscript Reverse Transcriptase II	Life Technologies	18064-014
Experion DNA 1K	Bio-Rad	700-7107
QuantiTect SyberGreen	Qiagen	204163
PE Cluster Generation Kit	Illumina	PE-401-3001
PhiX Kit di controllo	Illumina	FC110-301
200 Ciclo di SBS Kit	Illumina	FC-401-3001
HiScanSQ *	Illumina	SY-103-2001
CBOT	Illumina	SY-301-2002
qPCR macchina - Viia7	Life Technologies	Model # VIIA7 / Accessori # 10631261	O equivalente
Experion sistema	Bio Rad	7007001	Bioanalyzer è un sistema alternativo
Spettrofotometro	Bio-Tek	Spettrofotometro per micropiastre Epoch	O equivalente
Centrifuga - Sorvall Legenda XTR	Thermo Scientific	75004521	O equivalente
Supporto magnetico	Life Technologies	AM10027
96 pozzetti termociclatore	Generale Lab Fornitore
			Tabella 3. Elenco dei reagenti chiave e mi maggiorequipment. *, Nel video, invece di HiSeq1000 HiScanSQ è stata dimostrata.