Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Sommario

Un metodo per l'analisi quantitativa di temporizzazione cromosoma replica è descritto. Il metodo utilizza incorporazione di BrdU in combinazione con fluorescente In situ Ibridazione (FISH) per valutare la tempistica replicazione dei cromosomi di mammifero. Questa tecnica permette il confronto diretto dei cromosomi riarrangiati e un-riarrangiato all'interno della stessa cella.

Abstract

Replicazione del DNA di mammifero avvia in siti multipli lungo cromosomi in momenti diversi durante la fase S, seguendo un programma di replica temporale. La specifica dei tempi di replica è pensato per essere un processo dinamico regolato da stimoli tessuto-specifiche e di sviluppo che sono sensibili alle modificazioni epigenetiche. Tuttavia, i meccanismi che regolano dove e quando la replicazione del DNA inizia lungo cromosomi rimane poco chiaro. Cromosomi omologhi di solito replicare in modo sincrono, ma ci sono eccezioni a questa regola. Per esempio, in cellule di mammifero femmina uno dei due cromosomi X diventa tardiva replica attraverso un processo noto come inattivazione X ^1. Insieme a questo ritardo nella temporizzazione replica, stimato a 2-3 ore, la maggior parte dei geni diventano trascrizionalmente tacere su un cromosoma X. In aggiunta, una discreta azione cis locus, noto come il centro inattivazione X, regola questo processo di inattivazione X, compresi thinduzione e dei tempi di replica ritardata sul cromosoma X inattivo intero. Inoltre, alcuni riarrangiamenti trovano nelle cellule tumorali e cellule esposte a radiazioni ionizzanti visualizzare un significativo ritardo nella temporizzazione replica di> 3 ore che interessa l'intero cromosoma ^2,3. Un recente lavoro del nostro laboratorio indicano che l'alterazione di discreta azione cis autosomica risultato loci in un fenotipo estremamente tardiva replica che interessa l'intero cromosoma ^4. Ulteriori studi 'di ingegneria cromosomica' indicano che alcuni riarrangiamenti cromosomici che interessano molti risultati diversi cromosomi in questa anomala replica-timing fenotipo, suggerendo che tutti i cromosomi di mammifero contengono discrete cis-che agiscono loci che controllano tempistica corretta replicazione dei cromosomi individuali ^5.

Qui, presentiamo un metodo per l'analisi quantitativa di temporizzazione cromosoma replica combinato con ibridazione in situ fluorescente. Questometodo consente un confronto diretto di temporizzazione replica tra cromosomi omologhi all'interno della stessa cella, ed è stato adattato da ^6. Inoltre, questo metodo consente l'identificazione univoca di riarrangiamenti cromosomici che correlano con modifiche nei tempi di replica che interessano l'intero cromosoma. Questo metodo ha dei vantaggi rispetto recentemente sviluppato un elevato throughput di micro-array o sequenza protocolli che non è possibile distinguere tra alleli omologhi presenti sul riarrangiati e poco risistemato cromosomi. Inoltre, poiché il metodo descritto qui valuta singole cellule, si può rilevare variazioni di temporizzazione sulla replicazione cromosomica riarrangiamenti cromosomici che sono presenti in una frazione di cellule in una popolazione.

Protocollo

1. Incorporazione di BrdU (Etichettatura Terminal)

1. Cellule piastra per circa il 70% di confluenza di 150 mm in coltura tissutale piatto 24 ore prima dell'aggiunta di BrdU.
2. Sostituire il supporto con nuovi mezzi completi contenenti 20 mg / ml di BrdU (Sigma) ad intervalli di tempo appropriati prima del raccolto. La lunghezza del tempo cellule vengono coltivate in mezzi con BrdU varierà con il tipo di cella e specie, tipicamente la fase G2 dura tra 2 e 5 ore (Figura 1).

2. Harvest Cromosoma di colture monostrato Celle

1. Rimuovere terreni di coltura dalla piastra e raccogliere 10 ml in....

Risultati

Un esempio di analisi replica temporizzazione per cromosoma umano 6 è mostrato in Figura 2. Cellule contenenti una delezione del gene ASAR6 ^4, situato in 6q16.1, sono stati esposti a BrdU per 5 ore, le cellule raccolte per mitotici e trattati per FISH con sonda cromosoma 6 vernice (Vysis) e per incorporazione di BrdU. Notare che vi è una differenza significativa nella configurazione BrdU bande tra i due 6, che è coerente con un ritardo nella temporizzazione replica di> 2 ore per uno dei il.......

Discussione

La preparazione degli spread cromosoma è un passo fondamentale per il successo di replica-timing saggio descritto qui. L'inclusione di una fase di pretrattamento Colcemid prima del trattamento ipotonico può facilitare la frequenza e la diffusione delle cellule mitotiche. Abbiamo tipicamente esporre le cellule ad colcemdi per 1-3 ore prima del raccolto, e utilizzare Colcemid ad una concentrazione finale di 10 ug / ml. Tuttavia, l'inclusione di una fase di pretrattamento Colcemid può modificare la lunghezza di G2 .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Anti-BrdU-FITC	Roche Millipore	11202593001 MAB326F	50 pg / pl
Nick Traduzione Kit	Abbott Molecular (Vysis)	07J00-0001
Spectrum Arancione dUTP	Abbott Molecular (Vysis)	02N33-050
CEP	Abbott Molecular (Vysis)	Varia
LSI / WCP ibridazione tampone	Abbott Molecular (Vysis)	06J67-011
CEP ibridazione tampone	Abbott Molecular (Vysis)	07J36-001
Cromosoma painti	MetaSystems Gruppo	D-14NN-050-TR
Olympus BX61 microscopio a fluorescenza	Olimpo	BX61TRF-1-5
Microscopio di imaging del software di sistema	Applied Imaging	Cytovision 3.93.1
Macchina fotografica digitale	Olimpo	UCMAD3
			RICETTE IN ibridazione in situ Soluzioni Formammide 70% Formamide/2x SSC 35 ml di formammide * (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d 2 H 2 0 pH a 7,0 con HCl (Sigma) * E 'importante utilizzare formammide che è stato conservato a -20 ° C. Prolungata conservazione a temperatura ambiente genera acido formico e il w pHill essere troppo bassa. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 10 ml 10x SSC 15 ml dH 2 O pH a 7,0 con HCl (Sigma) SSC 20x, 4 L 702 g NaCl (Sigma) 358 g Na citrato (Sigma) dH 2 O a volume PN Buffer [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Effettuare una soluzione 0,1 M di fosfato di sodio ogni (Filtro sterilizzare e conservare in 500 ml aliquote). 0,1 M NaH 2 P0 4, 1 L 13,8 g di NaH 2 P0 4 (Sigma): dH 2 O a volume 0,1 M NaH 2 P0 4 1 L 14,2 g di NaH 2 P0 4 (Sigma) dH 2 O a volume. PN: Regolare il pH di 0,1 M Na 2 HP0 4 a pH 8,0 con 0,1 M NaH 2 P0 4. Filtro sterilizzare e aggiungere 1 ml di NP-40. PNM 50 ml 1.25 g non grassi del latte secco (Sigma) 25 ml tampone PN (ricetta sopra) Mescolare per 15-20 minuti mescolando costantemente. Spin 2 volte a 400 xg per 10 min. Utilizzare il surnatante, e fare attenzione a non disturbare proteine ​​del latte precipitate.