Matrix-assistito trapianto autologo di condrociti per il rimodellamento e la riparazione dei difetti condrali in un modello di coniglio

Markus T. Berninger; Gabriele Wexel; Ernst J. Rummeny; Andreas B. Imhoff; Martina Anton; Tobias D. Henning; Stephan Vogt

doi:10.3791/4422

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Articolo metodologico

Matrix-assistito trapianto autologo di condrociti per il rimodellamento e la riparazione dei difetti condrali in un modello di coniglio

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DOI:

10.3791/4422

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21 maggio 2013

Markus T. Berninger¹^,² , Gabriele Wexel³ , Ernst J. Rummeny² , Andreas B. Imhoff¹ , Martina Anton³ , Tobias D. Henning^*²^,⁴ , Stephan Vogt^*¹

¹Department of Orthopaedic Sports Medicine, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ²Department of Radiology, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ³Institute of Experimental Oncology and Therapy Research, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ⁴Department of Radiology, Uniklinik Köln

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Una tecnica sperimentale per il trattamento dei difetti condrali in ginocchio di coniglio è descritto. L'impianto di condrociti autologhi seminate su una matrice è un metodo ben accettato per il rimodellamento e la riparazione di lesioni della cartilagine articolare che fornisca risultati soddisfacenti a lungo termine. Matrix-assistito trapianto autologo di condrociti (MACT) offre un metodo standardizzato di impianto e clinicamente stabilita.

Abstract

Difetti della cartilagine articolare sono considerati un problema sanitario importante in quanto la cartilagine articolare ha una limitata capacità di auto-rigenerazione ^1. Lesioni cartilaginee non trattate portano a dolore in corso, influenzare negativamente la qualità della vita e di predisporre per l'artrosi. Durante gli ultimi decenni, diverse tecniche chirurgiche sono state sviluppate per il trattamento di tali lesioni. Tuttavia, finora non è stato possibile ottenere una riparazione completa in termini di copertura del difetto di cartilagine ialina articolare o di fornire recupero a lungo termine soddisfacenti ^2-4. Pertanto, le lesioni della cartilagine articolare rimane un obiettivo primario per le tecniche rigenerative come Tissue Engineering. A differenza di altre tecniche chirurgiche, che spesso portano alla formazione di tessuto fibroso o fibrocartilagineo, Tissue Engineering mira a ripristinare completamente la struttura complessa e le proprietà della cartilagine articolare originale utilizzando il potenziale condrogenico delle cellule trapiantate. Ralcune recenti sviluppi hanno aperto possibilità promettenti per le terapie rigenerative della cartilagine.

Il primo approccio basato cellulare per il trattamento di cartilagine a tutto spessore o lesioni osteocondrali è stata eseguita nel 1994 da Lars Peterson e Mats Brittberg pioniere clinico impianto di condrociti autologhi (ACI) ^5. Oggi, la tecnica è clinicamente ben consolidata per il trattamento dei grandi difetti della cartilagine ialina del ginocchio, il mantenimento di buoni risultati clinici anche 10 o 20 anni dopo l'impianto ^6. Negli ultimi anni, l'impianto di condrociti autologhi subito una progressione rapida. L'uso di un tridimensionale collageno-matrice artificiale su cui le cellule vengono successivamente reimpiantate diventata sempre più popolare ^7-9.

MACT compone di due procedure chirurgiche: in primo luogo, al fine di raccogliere condrociti, una biopsia cartilagine deve essere eseguita da una zona di cartilagine non sostengono pesi tgiunto egli ginocchio. Poi, condrociti vengono estratti, purificati e ampliato per un numero di cellule sufficiente in vitro. I condrociti sono poi seminate su una matrice tridimensionale e possono essere successivamente reimpiantati. Quando si prepara un impianto tissutale, tasso di proliferazione e la capacità di differenziazione sono cruciali per una rigenerazione dei tessuti di successo ^10. L'uso di una matrice tridimensionale come vettore cella è pensato per supportare queste caratteristiche cellulari ^11.

Il seguente protocollo riassumerà e dimostrare una tecnica per l'isolamento di condrociti da biopsie cartilagine, la loro proliferazione in vitro e loro semina su un 3D-matrice (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Svizzera). Infine, l'impianto degli cellula-matrice-costrutti in artificialmente creati difetti condrali del ginocchio di coniglio sarà descritto. Questa tecnica può essere utilizzata come ambiente sperimentaleper ulteriori esperimenti di riparazione della cartilagine.

Protocollo

A. Cartilagine Biopsia (Chirurgia in camera; passaggi 1-5 nella camera di preparazione non sterile)

Eseguire un controllo finale peso del coniglio (New Zealand White coniglio, femmina, 3,5-4,0 kg di peso corporeo, 6 mesi) per essere in grado di dose droghe correttamente e controllare il peso conseguente alla chirurgia.
Indurre l'anestesia per il coniglio da una iniezione endovenosa di 10 mg / kg di propofol.
Dopo l'intubazione, mantenere l'anestesia con 1,5 mg / kg / min propofol e 0,05 mg / kg di fentanil per via endovenosa. Monitorare l'anestesia utilizzando capnography, pulsossimetria e la frequenza cardiaca.
Shave il ginocchio da operare con un tagliatore elettrico e vuoto la pelliccia.
Disinfettare il ginocchio rasato accuratamente e coprire il resto del coniglio con una garza sterile.
Palpare la rotula ed eseguire una incisione cutanea mediale della rotula.
Aprire l'articolazione del ginocchio da una artrotomia mediale parapatellare in condizioni sterili. Cercate di evitare il taglio di qualsiasi piccola suvasi sanguigni perficial.
Spostare la rotula lateralmente.
Ispezionare l'articolazione del ginocchio per eventuali anomalie e lesioni cartilaginee macroscopiche.
Rimuovere con cautela piccoli pezzi di cartilagine (2-3 mm) fuori della troclea femorale ossis con un bisturi sterile (Figura 1).
Porre immediatamente queste biopsie cartilaginee in un tubo da 50 ml con terreno completo (DMEM + 10% di siero fetale bovino (FCS) + 1% di penicillina / streptomicina (Pen / Strep)) per continuare con la cultura in vitro destra dopo l'operazione.
Pulire i difetti e sciacquare con soluzione salina sterile.
Riposizionare la rotula nel solco trocleare.
Chiusura della ferita a strati con bottone singolo suture (4-0 Vicryl) e una sutura cutanea continua (4-0 Monocryl). Utilizzare materiale di sutura riassorbibile.
Infine, sigillare la ferita con uno spray medicazione permeabile al vapore acqueo.

B. In vitro Cultura

Elabora la biopsia cpezzi il più presto possibile dopo l'operazione in una cappa a flusso laminare sterile cultura del tessuto artilage.
Lavare la sterile raccolto cartilagine 2x in PBS con successiva centrifugazione a 500 xg per 3 min a RT.
Tagliare cartilagine in pezzi da 1 mm ^3, trasferimento ad un Falcon 50 ml e digerire loro su un agitatore per 30 minuti con 10 ml di tripsina-EDTA (0,25%) e 10 ml di PBS per 30 min
Dopo 30 min, interrompere tripsinizzazione aggiungendo mezzo completo. Poi, scuotere i pezzi di cartilagine per un altro per 12 ore con collagenasi A (0,21 U / mg) in mezzo privo di siero (DMEM + 1% Pen / Strep).
Centrifugare la soluzione risultante a 170 xg per 3 min a RT.
Risospendere pellet cellulare in 5 ml di terreno completo.
Seed i condrociti isolati su a 25 cm ² di tessuto cultura palloni in 5 ml di terreno completo e conservare in un umidificata tessuto cultura incubatore a 37 ° C, 5% di CO _2.
Condrociti crescere ad una densità di 80%.
Rilasciare le cellule di from boccette di lavaggio in PBS 2x prima di esporre al 0,05% tripsina-EDTA per 3 min. Una volta condrociti staccano, stop tripsinizzazione con l'aggiunta di 10 microlitri terreno completo.
Centrifugare la sospensione di 300 g (3 min) e risospendere pellet in terreno completo.
Cellule di semi in fiasche di coltura tissutale (75 cm ²⁾ e Split con un rapporto di 1:3 (~ 5.000 cellule / cm ²⁾ ogni 5 ^° giorno o al momento 80% di confluenza.
Determinare i numeri di cellulare e la vitalità di blu tripano colorazione.

C. Cell-semina di Matrix

Prima del lavaggio impianto e cellule di rilascio come descritto sopra. Eseguire la conta cellulare e trasferire 5 x 10 ⁴ cellule in una provetta da 1,5 ml. Quindi centrifugare a 500 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
Risospendere il pellet in 15 microlitri mezzo completo per una completa saturazione della matrice.
Tagliare il doppio strato di collagene patibolo per le dimensioni esatte del difetto trocleare da una biopsia sterilepugno.
Posto matrice in un piatto di coltura tissutale di dimensioni appropriate (come piastre da 24 pozzetti).
Piastrare sul lato poroso, cellula-adesivo della matrice. Questo scoraggia migrazione cellulare lontano dalla matrice.
Lascia cellula-teste di serie matrici senza ulteriore mezzo di coltura cellulare all'interno di un incubatore per 1 ora per consentire la piena aderenza dei condrociti.
Poi, posto cellula-matrice-costrutti in contenitori di coltura (ad esempio piastre da 24 pozzetti) con terreno fresco completo. Fare attenzione a non lavare le cellule fuori della matrice, anche se forte aderenza è previsto.
Ora, cellula-matrice-costrutti possono essere adottate per la sala operatoria per il re-impianto.

D. matrix-assisted trapianto autologo di condrociti

Eseguire artrotomia parapatellare al ginocchio controlaterale come descritto sopra (A. 1-8).
Creare due isolati difetti condrali nel solco trocleare con un operatin aria sterileg trapano (3,6 mm di diametro).
Pulire il difetto e sciacquare con soluzione salina sterile.
Occorre prestare attenzione a non aprire la cavità midollare, in qualsiasi momento. Se necessario, sigillare il fondo dei difetti con cauterizzazione elettrica contro sanguinamento.
Impiantare le matrici seminate con i condrociti in coltura con la porosa lato rivolto verso il basso (Figura 2). Poi press-fit nei fori e lavare la superficie circostante.
Sigillare le matrici impiantati con un po 'di colla di fibrina (Tissucol Duo S) per assicurare la fissazione sicura.
Dopo la coagulazione, riposizionare la rotula nel solco trocleare e applicare la gamma completa di movimento al ginocchio un paio di volte.
Spostare lateralmente, ancora una volta la rotula e verificare la presenza di qualsiasi evento o segno di fissazione instabile. Le matrici devono essere tenute ancora in vigore.
Sostituire nuovamente la rotula e terminare l'operazione con chiusura della ferita in strati e spray medicazione come descritto sopra.