Il trattamento dei difetti osteocondrali del ginocchio congiunta del Coniglio con impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in coaguli di fibrina

Markus T. Berninger; Gabriele Wexel; Ernst J. Rummeny; Andreas B. Imhoff; Martina Anton; Tobias D. Henning; Stephan Vogt

doi:10.3791/4423

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Articolo metodologico

Il trattamento dei difetti osteocondrali del ginocchio congiunta del Coniglio con impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in coaguli di fibrina

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DOI:

10.3791/4423

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21 maggio 2013

Markus T. Berninger¹^,² , Gabriele Wexel³ , Ernst J. Rummeny² , Andreas B. Imhoff¹ , Martina Anton³ , Tobias D. Henning^*²^,⁴ , Stephan Vogt^*¹

¹Department of Orthopaedic Sports Medicine, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ²Department of Radiology, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ³Institute of Experimental Oncology and Therapy Research, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ⁴Department of Radiology, Uniklinik Köln

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Una tecnica sperimentale per il trattamento dei difetti osteocondrali nel ginocchio del coniglio è descritto. L'impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in difetti osteocondrali fornisce una promettente sviluppo nel campo dell'ingegneria dei tessuti. La preparazione di fibrina-cell-coaguli In vitro Offre un metodo standardizzato per l'impianto.

Abstract

Il trattamento dei difetti osteocondrali articolari ha rappresentato una sfida per i medici da molti anni. La migliore comprensione delle interazioni tra cartilagine articolare e osso subcondrale negli ultimi anni ha portato a un crescente interesse nel ripristino dell'intera unità osteocondrale. Rispetto alle lesioni condrali, la rigenerazione dei difetti osteocondrali è molto più complessa e costituisce una sfida chirurgica e terapeutica notevolmente maggiore. Il tessuto danneggiato non comprende soltanto lo strato superficiale di cartilagine, ma anche l'osso subcondrale. Per danni profondi, di tipo osteocondrale, come quelli che si verificano ad esempio nell'osteochondrosis dissecans, è necessario sostituire l'intera profondità del difetto al fine di ripristinare la superficie articolare ¹. Le procedure terapeutiche idonee devono tenere conto di questi due tessuti diversi e del loro diverso potenziale intrinseco di guarigione ². Negli ultimi decenni, diverse opzioni di trattamento chirurgico si sono sviluppate e sono già state affermate a livello clinico ^3-6.

I trapianti osteocondrali autologhi o allogenici consistono in cartilagine articolare e osso sottocartilagineo e permettono la sostituzione dell'intera unità osteocondrale. I difetti vengono riempiti con innesti osteocondrali cilindrici che mirano a fornire una superficie congruente rivestita da cartilagine ialina ^3,7,8. Gli svantaggi includono la quantità limitata di innesti disponibili, la morbidità del sito donatore (per innesti autologhi) e l'incongruenza della superficie; pertanto, l'applicazione di questo metodo è particolarmente limitata nei difetti di grandi dimensioni.

Nuovi approcci nel campo dell'ingegneria tissutale hanno aperto prospettive promettenti per la terapia rigenerativa osteocondrale. L'impianto di condrociti autologhi ha rappresentato il primo approccio biologico basato su cellule per il trattamento di lesioni cartilaginee a tutto spessore ed è ora affermato a livello mondiale con buoni risultati clinici anche a 10-20 anni dall'impianto ^9,10. Tuttavia, ad oggi, questa tecnica non è adatta al trattamento di tutti i tipi di lesioni, come ad esempio difetti profondi che coinvolgono l'osso subcondrale ¹¹.

La tecnica a sandwich combina l'innesto osseo con gli approcci attuali nell'ingegneria tissutale ^5,6. Questa combinazione sembra in grado di superare i limiti osservati negli innesti osteocondrali da soli. Dopo l'innesto osseo autologo nell'area del difetto subcondrale, una membrana seminata con condrociti autologhi viene suturata al di sopra e facilita l'allineamento della topologia dell'innesto con il sito lesivo. Ovviamente, la ricostruzione ossea precedente richiede un tempo chirurgico aggiuntivo e spesso persino un intervento supplementare. Inoltre, ad oggi, mancano dati a lungo termine ¹².

L'ingegneria tissutale senza innesto osseo aggiuntivo mira a ripristinare la struttura complessa e le proprietà della cartilagine articolare nativa attraverso il potenziale condrogenico e osteogenico delle cellule trapiantate. Tuttavia, anche in questo caso, è di solito solo il tessuto cartilagineo a essere più o meno rigenerato. Un danno osteocondrale aggiuntivo richiede un trattamento specifico ulteriore. Per ottenere una rigenerazione della struttura multistratificata dei difetti osteocondrali, prodotti ingegnerizzati tridimensionali seminati con cellule autologhe/allogeneiche potrebbero fornire una buona capacità rigenerativa ¹¹.

Oltre ai condrociti autologhi, le cellule staminali mesenchimali (MSC) sembrano rappresentare un'alternativa interessante per lo sviluppo di un tessuto cartilagineo a spessore completo. In numerosi studi preclinici in vitro e in vivo, le cellule staminali mesenchimali hanno dimostrato un eccellente potenziale rigenerativo del tessuto ^13,14. Un vantaggio importante delle cellule staminali mesenchimali, specialmente per il trattamento dei difetti osteocondrali, è la loro capacità di differenziarsi sia in osteociti che in condrociti. Pertanto, esse potrebbero consentire una rigenerazione multistrato del difetto.

Negli ultimi anni, diversi scaffold con potenziale rigenerativo osteocondrale sono stati sviluppati e valutati, ottenendo risultati preliminari promettenti ^1,15-18. Inoltre, la colla di fibrina come veicolo cellulare si è rivelata una delle tecniche preferite nel ripristino sperimentale della cartilagine ed è già stata utilizzata con successo in diversi studi sugli animali ^19-21 e persino nei primi studi sull'uomo ²².

Il seguente protocollo illustrerà una tecnica sperimentale per l'isolamento di cellule staminali mesenchimali dal midollo osseo di un coniglio, per la successiva proliferazione in coltura cellulare e per la preparazione di un modello standardizzato in vitro di coaguli fibrinici cellulari. Infine, verrà descritta una tecnica per l'impianto di coaguli fibrinici cellulari preformati in difetti osteocondrali artificiali dell'articolazione del ginocchio del coniglio.

Protocollo

A. Preparazione di un coniglio dei donatori per l'isolamento di cellule staminali mesenchimali (Chirurgia Camera)

Le cellule sono isolate dal maschio Nuova Zelanda bianchi (NZW) conigli all'età di 4 mesi e di circa 3 kg di peso corporeo.
Indurre l'anestesia con propofol (10 mg / kg di peso corporeo iv) e il sacrificio con sodio pentobarbital (100 mg / kg di peso corporeo iv).
Shave pelliccia da arti posteriori, schiena e pancia con un tagliatore elettrico e aspirare la pelliccia.
Disinfettare accuratamente la zona rasata con il 70% di etanolo.
Utilizzare pinze smussato, forbici affilate (o bisturi) e frese per il tessuto osseo e legamenti.
Fare un'incisione lungo la superficie craniale della gamba e del polpaccio.
Riflettere cute e del tessuto sottocutaneo da una dissezione tagliente o contundente.
Distinti muscoli e legamenti di tibia e del femore. Mantenere tagli come vicino all'osso possibile per fare una dissezione pulito. Non separare femore dalla tibia in questo momento.
Tagliare through l'anca per separare la testa del femore dalla dell'acetabolo.
Elevare il complesso tibio-femorale.
Utilizzare il bisturi per togliere qualsiasi tessuto molle restante dalle ossa o strofinare le ossa con i tessuti panno sterile. A questo punto, femore e tibia sono ancora connessi.
Rimuovere rotula da taglio, quindi tagliare ginocchio legamenti articolari alle ossa distinte infine.
Spray ossa separato con il 70% di etanolo, lasciare asciugare e mettere ogni osso in un tubo da centrifuga da 50 ml con mezzo di coltura cellulare (DMEM + 1% di penicillina / streptomicina (Pen / Strep)) per mantenerli umidi.
Ora passare sotto una cultura cappa a flusso laminare sterile cella.

B. Flushing del Coniglio MSC da Ossa e di espansione (Cell Culture Hood)

Raccogliere le ossa da tubi e metterli in 150 millimetri piatti utilizzando pinze sterili.
Rimuovere entrambi osso finisce con una sega sterile e pezzi trasferirsi a New mm piatti 150.
Riempire una siringa da 10 ml con medium (DMEM), collegare un ago di calibro 18 e inserire nell'apertura del midollo osseo.
Poi, sciacquare cavità midollare con il mezzo per svuotare il midollo osseo nel piatto. Successivamente sciacquare dall'altra estremità, se possibile. Se necessario, segare più dalle estremità. Se osso dovesse rompere, basta lavare l'interno dell'osso.
Aspirare sospensione medie cella nella siringa e sciacquare il midollo osseo ripetutamente fino sospensione è libera fluttuante attraverso il midollo osseo cavità e nessuna ulteriore midollo osseo coaguli compaiono.
Una volta che il midollo osseo è stato raccolto da tutte le ossa, disturbare i ciuffi di midollo passando attraverso un ago di calibro 18: Riempire una siringa con ago e forza fuori in mezzo.
Successivamente, filtrare la sospensione attraverso un filtro cella in un tubo da 50 ml. Al fine di prevenire la perdita di cellule, lavare coltura piatto 2x con 10 ml di mezzo e filtrare pure.
Centrifugare sospensione a 500 xg per 5 min a RT.
Rimuovere il surnatante e risospendere cella pellet in 10 ml di terreno (DMEM + 1% Pen / Strep).
Globuli separati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e cellule staminali mesenchimali (MSC) usando una soluzione Biocoll separazione.
Riempire 5 ml di Biocoll Separare soluzione in una provetta da 15 ml e aggiungere cautamente 5 ml di sospensione cellulare in cima e centrifugare a 800 xg per 20 min a TA (senza freno).
Possibili risultati vedi Figura 1: Essendo più denso rispetto Biocoll, globuli rossi sedimenti sul fondo, mentre le cellule staminali mesenchimali PBMC e rimangono all'interfaccia.
Rimuovere con attenzione l'interfaccia in un tubo da 15 ml e lavare con 5 ml di PBS.
Centrifugare come descritto al punto 22, risospendere in 5 ml di PBS e ripetere 2-3x.
Poi, centrifugare nuovamente a 350 xg per 10 min a TA (con freno).
Risospendere in 10 ml di mezzo e contare le cellule in un emocitometro.
Cellule piastra ad una densità di semina iniziale di circa 5 x 10 ⁶ a 150 millimetri piatti.
Dopo 2-3 giorni, rispostare cellule non aderenti. Potrebbe essere necessario lavare con PBS prima al fine di rimuovere i detriti cellulari. Aggiungere mezzo fresco completo (DMEM + 10% di siero fetale di vitello (FCS) + 1% Pen / Strep) dopo.
Nutrire le cellule ogni 3-4 giorni (Figura 2).
Dopo 5-10 giorni, passaggio alle cellule per la prima volta.

C. Preparazione di coaguli di fibrina in vitro

Al giorno di impianto, rilasciate da cellule aderenti beute / stoviglie da 3 min-esposizione al 0,25% tripsina-EDTA. Arrestare tripsinizzazione aggiungendo mezzo completo.
Distribuire le cellule in una provetta da 50 falco e lavare due volte con PBS.
Determinare la vitalità cellulare e numeri blu tripano colorazione.
Aggiungi 50.000 cellule / provetta e raccogliere pellet per centrifugazione a 500 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Preparare una mastermix per almeno un altro coagulo come necessario.
Risospendere il pellet di cellule in 17 ml di PBS e mescolare 25 ml di componente di fibrinogeno di TISSUCOL-Kit con questo 17 microlitri di sospensione MSC.
Prendete un piatto sterile con fori predisposti (3x3.6 mm), in conformità ai fori in vivo (Figura 3).
Prima, inoculare 4 microlitri soluzione di trombina (500 UI / ml) in un foro, seguita da aggiunta di 42 microlitri immediato fibrinogeno-cell-sospensione e nuovo 4 microlitri soluzione di trombina in cima. Non mescolare la sospensione per evitare la coagulazione nella punta della pipetta. Prima, il volume di 50 microlitri della pipettato fibrinogeno-cell-sospensione sporgerà il bordo dei fori pre-forati senza fondere a causa della tensione superficiale. Tuttavia, dopo la completa coagulazione (dopo 60 min) il coagulo si contrae e si inserisce nel pre-foro.
Rimuovere il coagulo con cura utilizzando una pinza smussato e posto in una provetta con PBS. Preparare 2 coaguli / animali.
Prendete i coaguli in sala operatoria.

D. L'impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in coaguli di fibrina

Indurre l'anestesia di coniglio (NZW, maschio, 3,5-4,0 kg di peso corporeo, 5-6 mesi di età) per iniezione endovenosa di propofol (10 mg / kg di peso corporeo).
Shave il ginocchio da operare con un tagliatore elettrico e vuoto la pelliccia. Tutte le procedure denominate prima vengono eseguite in una camera di preparazione intervento chirurgico per evitare la contaminazione dell'ambiente sterile della sala operatoria.
Dopo l'intubazione, mantenere l'anestesia con 1.5 mg / kg / min propofol e 0,05 mg / kg / min fentanil per via endovenosa. Monitorare l'anestesia utilizzando capnography, pulsossimetria e la frequenza cardiaca.
Disinfettare il ginocchio rasato accuratamente e coprire il resto del coniglio con una medicazione sterile.
Palpare la rotula ed eseguire una incisione cutanea mediale della rotula.
Aprire l'articolazione del ginocchio da una artrotomia mediale parapatellare in condizioni sterili. Cercate di evitare di tagliare i piccoli vasi sanguigni superficiali.
Spostare la rotula lateralmente (figura 4).
Dopo INSPEction dell'articolazione del ginocchio per le lesioni cartilaginee concomitanti o anomalie comuni, creare due difetti osteocondrali (di profondità 3 mm figura a forma di otto) nel solco trocleare con aria sterile trapano elettrico di funzionamento (3,6 millimetri di diametro) con un dispositivo di arresto (Figura 5).
Pulire i difetti e sciacquare con soluzione salina sterile.
Prima dell'impianto, riempire 20 pl di colla di fibrina nei difetti e distribuirli uniformemente sul fondo del difetto.
Poi impiantare i coaguli inserito a pressione nella figura difetto a forma di otto.
Dopo la coagulazione, riposizionare la rotula nel solco trocleare e piegare e distendere il ginocchio un paio di volte.
Spostare lateralmente, ancora una volta la rotula e verificare se il fibrinogeno-cellulari-coaguli sono ancora al loro posto.
Sostituire nuovamente la rotula e terminare l'operazione con chiusura della ferita a strati con bottone singolo suture (4-0 Vicryl) e una sutura cutanea continuo (4-0 Monocryl) (entrambe con sutura riassorbibilemateriale).
Infine, sigillare la ferita con uno spray medicazione permeabile al vapore acqueo.
Per assistenza post-operatoria, la ferita viene controllato giorno per 7 giorni. I conigli ricevono per la post-operatoria analgesia Carprofen 4 mg / kg sc ogni 24 ore (per 4 giorni) e Buprenorphin 0,03 mg / kg sc ogni 12 ore (per 2,5 giorni). Una stabilizzazione del ginocchio (es. medicazione) non è necessaria.