Una tecnica sperimentale per il trattamento dei difetti osteocondrali nel ginocchio del coniglio è descritto. L'impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in difetti osteocondrali fornisce una promettente sviluppo nel campo dell'ingegneria dei tessuti. La preparazione di fibrina-cell-coaguli In vitro Offre un metodo standardizzato per l'impianto.
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Articolo metodologico
Il trattamento dei difetti osteocondrali del ginocchio congiunta del Coniglio con impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in coaguli di fibrina
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il trattamento dei difetti osteocondrali articolari ha rappresentato una sfida per i medici da molti anni. La migliore comprensione delle interazioni tra cartilagine articolare e osso subcondrale negli ultimi anni ha portato a un crescente interesse nel ripristino dell'intera unità osteocondrale. Rispetto alle lesioni condrali, la rigenerazione dei difetti osteocondrali è molto più complessa e costituisce una sfida chirurgica e terapeutica notevolmente maggiore. Il tessuto danneggiato non comprende soltanto lo strato superficiale di cartilagine, ma anche l'osso subcondrale. Per danni profondi, di tipo osteocondrale, come quelli che si verificano ad esempio nell'osteochondrosis dissecans, è necessario sostituire l'intera profondità del difetto al fine di ripristinare la superficie articolare 1. Le procedure terapeutiche idonee devono tenere conto di questi due tessuti diversi e del loro diverso potenziale intrinseco di guarigione 2. Negli ultimi decenni, diverse opzioni di trattamento chirurgico si sono sviluppate e sono già state affermate a livello clinico 3-6.
I trapianti osteocondrali autologhi o allogenici consistono in cartilagine articolare e osso sottocartilagineo e permettono la sostituzione dell'intera unità osteocondrale. I difetti vengono riempiti con innesti osteocondrali cilindrici che mirano a fornire una superficie congruente rivestita da cartilagine ialina 3,7,8. Gli svantaggi includono la quantità limitata di innesti disponibili, la morbidità del sito donatore (per innesti autologhi) e l'incongruenza della superficie; pertanto, l'applicazione di questo metodo è particolarmente limitata nei difetti di grandi dimensioni.
Nuovi approcci nel campo dell'ingegneria tissutale hanno aperto prospettive promettenti per la terapia rigenerativa osteocondrale. L'impianto di condrociti autologhi ha rappresentato il primo approccio biologico basato su cellule per il trattamento di lesioni cartilaginee a tutto spessore ed è ora affermato a livello mondiale con buoni risultati clinici anche a 10-20 anni dall'impianto 9,10. Tuttavia, ad oggi, questa tecnica non è adatta al trattamento di tutti i tipi di lesioni, come ad esempio difetti profondi che coinvolgono l'osso subcondrale 11.
La tecnica a sandwich combina l'innesto osseo con gli approcci attuali nell'ingegneria tissutale 5,6. Questa combinazione sembra in grado di superare i limiti osservati negli innesti osteocondrali da soli. Dopo l'innesto osseo autologo nell'area del difetto subcondrale, una membrana seminata con condrociti autologhi viene suturata al di sopra e facilita l'allineamento della topologia dell'innesto con il sito lesivo. Ovviamente, la ricostruzione ossea precedente richiede un tempo chirurgico aggiuntivo e spesso persino un intervento supplementare. Inoltre, ad oggi, mancano dati a lungo termine 12.
L'ingegneria tissutale senza innesto osseo aggiuntivo mira a ripristinare la struttura complessa e le proprietà della cartilagine articolare nativa attraverso il potenziale condrogenico e osteogenico delle cellule trapiantate. Tuttavia, anche in questo caso, è di solito solo il tessuto cartilagineo a essere più o meno rigenerato. Un danno osteocondrale aggiuntivo richiede un trattamento specifico ulteriore. Per ottenere una rigenerazione della struttura multistratificata dei difetti osteocondrali, prodotti ingegnerizzati tridimensionali seminati con cellule autologhe/allogeneiche potrebbero fornire una buona capacità rigenerativa 11.
Oltre ai condrociti autologhi, le cellule staminali mesenchimali (MSC) sembrano rappresentare un'alternativa interessante per lo sviluppo di un tessuto cartilagineo a spessore completo. In numerosi studi preclinici in vitro e in vivo, le cellule staminali mesenchimali hanno dimostrato un eccellente potenziale rigenerativo del tessuto 13,14. Un vantaggio importante delle cellule staminali mesenchimali, specialmente per il trattamento dei difetti osteocondrali, è la loro capacità di differenziarsi sia in osteociti che in condrociti. Pertanto, esse potrebbero consentire una rigenerazione multistrato del difetto.
Negli ultimi anni, diversi scaffold con potenziale rigenerativo osteocondrale sono stati sviluppati e valutati, ottenendo risultati preliminari promettenti 1,15-18. Inoltre, la colla di fibrina come veicolo cellulare si è rivelata una delle tecniche preferite nel ripristino sperimentale della cartilagine ed è già stata utilizzata con successo in diversi studi sugli animali 19-21 e persino nei primi studi sull'uomo 22.
Il seguente protocollo illustrerà una tecnica sperimentale per l'isolamento di cellule staminali mesenchimali dal midollo osseo di un coniglio, per la successiva proliferazione in coltura cellulare e per la preparazione di un modello standardizzato in vitro di coaguli fibrinici cellulari. Infine, verrà descritta una tecnica per l'impianto di coaguli fibrinici cellulari preformati in difetti osteocondrali artificiali dell'articolazione del ginocchio del coniglio.
Protocollo
A. Preparazione di un coniglio dei donatori per l'isolamento di cellule staminali mesenchimali (Chirurgia Camera)
- Le cellule sono isolate dal maschio Nuova Zelanda bianchi (NZW) conigli all'età di 4 mesi e di circa 3 kg di peso corporeo.
- Indurre l'anestesia con propofol (10 mg / kg di peso corporeo iv) e il sacrificio con sodio pentobarbital (100 mg / kg di peso corporeo iv).
- Shave pelliccia da arti posteriori, schiena e pancia con un tagliatore elettrico e aspirare la pelliccia.
- Disinfettare accuratamente la zona rasata con il 70% di etanolo.
- Utilizzare pinze smussato, forbici affilate (o bisturi) e fres....
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Risultati
La tecnica chirurgica descritta permette un isolamento di successo e impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in un difetto osteocondrale artificiale. Il setup sperimentale ha comportato una integrazione dell'impianto nella cartilagine circostante.
Il difetto è stato riempito da riparazione dei tessuti con proprietà biomeccaniche simili e durata simile rispetto alla cartilagine circostante. La fibrina-cell-coagulo è stato preparato in vitro su un piatto sterile con.......
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Discussione
Negli ultimi anni, la possibilità di trattare complesse articolari difetti osteocondrali - come ad esempio quelli derivanti da osteocondrite dissecante, osteonecrosi e traumi - con approcci di ingegneria dei tessuti è diventato sempre più attraente. Nelle entità patologiche precedentemente menzionati, danno tissutale estende all'osso subcondrale e coinvolge due tessuti caratterizzati da differenti capacità curative intrinseche 1. Vi è un interesse crescente per il ruolo di osso subcondrale per i processi .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato finanziato dalla German Research Association (concessione HE 4578/3-1) e in parte dal 7 ° PQ UE-Progetto "GAMBA" NMP3-SL-2010-245993.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| FCS | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillina/Streptomicina | Biochrom AG | A 2210 | 1.000 unità/10 μg/μl in NaCl 0,9% |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Etilene (70%) | Merck KGaA | 410230 | |
| Soluzione di Blu di Tripano (0,4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Biocoll Soluzione di Separazione | Biochrom AG | L6115 | Soluzione isotonica Densità: 1,077 g/ml |
| Tripsina-EDTA 0,05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
| Fentanil | DeltaSelectGmBH | 1819340 | |
| Soluzione di NaCl (0,9%) | BBraun | 8333A193 | |
| Siringhe (Injekt) | BBraun | 4606108V | |
| Aghi (Sterican) | BBraun | 4657519 | |
| Pinze (smussate/appuntite) | Aesculap | ||
| Forbici | Aesculap | ||
| Bisturi | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
| Pipette per ricerca | Eppendorf | ||
| Tagliaossa | Aesculap | ||
| Piastre per colture cellulari 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Superficie di crescita 60,1 mm2/147,8 mm2 |
| Flaconi per colture cellulari 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Tubi da centrifuga (50 ml) | TPP AG | 91050 | Sterilizzati con raggi gamma |
| Incubatore CO2 | Forma Scientific Inc. | ||
| Cappa a flusso laminare per colture cellulari Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
| Sega sterile | Aesculap | ||
| Centrifuga Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
| Emocitometro | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trapano pneumatico | Aesculap | ||
| Kit TISSUCOL 1,0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
| Fili (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl) | Ethicon | ||
| Medicazione spray (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeabile al vapore acqueo |
Riferimenti
- Kon, E., et al. Novel nano-composite multilayered biomaterial for osteochondral regeneration: a pilot clinical trial. The American Journal of Sports Medicine. 39, 1180-1190 (2011).
- Kon, E., et al.
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Ristampe e permessi
