A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di<em&gt; Cotyledon Arabidopsis</emEpidermide&gt; durante la germinazione

Sommario

Descriviamo un protocollo mediante diapositive da camera e media per immobilizzare cotiledoni di impianto per l'imaging confocale dell'epidermide più giorni di sviluppo, documentazione differenziazione stomatica. Proteine ​​fluoroforo-tag possono essere monitorati in modo dinamico attraverso l'espressione e la localizzazione subcellulare, aumentare la comprensione dei ruoli possibili durante la divisione cellulare e la differenziazione delle cellule-tipo.

Abstract

Imaging nella dinamica in vivo del comportamento cellulare durante una sequenza di sviluppo può essere una potente tecnica per capire la meccanica del patterning tessuto. Durante lo sviluppo degli animali, la proliferazione cellulare e gli eventi chiave di patterning avvenire molto rapidamente. Per esempio, in Caenorhabditis elegans tutte le divisioni cellulari necessarie per il piano di corpo larvale vengono completate entro sei ore dopo la fecondazione, con sette cicli mitotici ^1; le mitosi sedici o più di embriogenesi Drosophila si verificano in meno di 24 ore ^2. In contrasto, le divisioni cellulari durante lo sviluppo della pianta sono lenti, tipicamente dell'ordine di un giorno ^3,4,5. Questo impone una sfida unica e la necessità di lungo termine di imaging in tempo reale per documentare comportamenti dinamici di divisione cellulare e di eventi di differenziazione durante l'organogenesi pianta. Epidermide Arabidopsis è un sistema eccellente modello per la segnalazione inquirenti, il destino della cellula, e lo sviluppo delle piante. Nel cotiledone, questo tessuto è composto da aria e ad acqua cellule resistenti pavimentazione intervallati da stomi uniformemente distribuito, valvole che si aprono e chiudono per controllare lo scambio di gas e la perdita di acqua. Spaziatura corretta di questi stomi è fondamentale per la loro funzione, e il loro sviluppo segue una sequenza di divisione asimmetrica e gradini di differenziazione cellulare per produrre l'epidermide organizzata (Fig. 1).

Questo protocollo permette l'osservazione di cellule e proteine ​​nell'epidermide più giorni di sviluppo. Questo lasso di tempo permette una precisa documentazione di cellule staminali divisioni e differenziazione delle cellule epidermiche, tra cui stomi e le cellule epidermiche pavimentazione. Proteine ​​fluorescenti possono essere fusi a proteine ​​di interesse per valutare la dinamica durante la divisione cellulare e processi di differenziazione. Questa tecnica permette di comprendere la localizzazione di una nuova proteina, POLAR ^6, durante la fase di proliferazione di cellule di lignaggio stomatica-in the cotiledone epidermide Arabidopsis, in cui è espresso in cellule precedenti eventi divisione asimmetrica e si muove a una caratteristica zona della corteccia cella poco prima della divisione si verifica. Le immagini possono essere registrate e video razionalizzato facilmente realizzato utilizzando il software di pubblico dominio per visualizzare la localizzazione dinamica delle proteine ​​e tipi di cellule che cambiano nel corso del tempo.

Protocollo

1. Seed Sterilizzazione

1. Preparare soluzione di sterilizzazione delle sementi: candeggina per uso domestico al 33%, 0.1% Triton X-100.
2. Semi place trasportano desiderato costrutto fluorescente reporter (s) e genotipo (s) in 1.7 ml e applicare 1 ml di soluzione di sterilizzazione. Incubare il nutator per 15 min.
3. In una cappa sterile, utilizzare una pipetta per rimuovere la soluzione di sterilizzazione da tubo, lasciando dietro di semi. Lavare con 1 ml di acqua sterile. Ripetere quattro volte.
4. Incubare a 4 ° C per due o più giorni.

2. Preparazione di Slide media Camera

1. Mescolare 20 ml ....

Risultati

Una serie di punti temporali informativi raccolti con questo metodo è illustrato nella figura 3. Le membrane cellulari sono etichettati con RFP (pm-rb) e GFP è fusa alla proteina POLAR sotto il suo promotore nativo (POLAR :: POLAR-GFP) ⁶ A 30 minuti scala di tempo, vediamo divisioni cellulari con i cambiamenti nella localizzazione delle proteine precedute. Divisioni cellulari asimmetriche nella forma lignaggio degli stomi delle cellule staminali-come precursori chiamati stomi m.......

Discussione

Questo time-lapse tecnica confocale per studi longitudinali di espressione della proteina fluorescente tag e localizzazione in singole cellule dell'epidermide cotiledone Arabidopsis, che nel caso delle proteine ​​che cambiano dinamicamente POLARI e gli altri è fondamentale per una corretta comprensione della loro funzione. Precedentemente, sostenuta immagini time lapse è stato utilizzato per esaminare infezione fungina Arabidopsis radice ¹¹ e crescita meristema ^5,12, ma aggiun.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bacto Agar	BD	214010
One-camera di scorrimento	Nunc (Thermo Scientific)	155360	O due-camera (155379)
Microscopio a scansione laser confocale	Zeiss	LSM700	Zen 2009 software
20x lente dell'obiettivo	Zeiss	420650-9901	NA 0.8, Plan-Apochromat
Dissezione microscopio	Benz (Nazionale)	431TBL	Si illumina dal basso
# 5 pinze, biologia punta	Roboz strumento chirurgico	RS-4978	Punte molto sottilisono critiche