Etichettando i domini extracellulari dei recettori di membrana con pHluorin superecliptic, e da imaging questi recettori di fusione in neuroni di topo in coltura, si può visualizzare direttamente i singoli eventi di inserzione vescicolari dei recettori della membrana plasmatica. Questa tecnica sarà determinante per chiarire i meccanismi molecolari che regolano l'inserimento recettore alla membrana plasmatica.
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Articolo metodologico
Imaging pHluorin-tagged inserimento recettore alla membrana plasmatica nella Primaria neuroni mouse coltivate
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una migliore comprensione dei meccanismi che regolano il traffico tra il recettore di membrana plasmatica (PM) e compartimenti intracellulari richiede un approccio sperimentale con ottime risoluzioni spaziali e temporali. Inoltre, tale approccio deve inoltre essere in grado di distinguere recettori localizzati sulla PM da quelli in compartimenti intracellulari. Soprattutto, rilevando recettori in una vescicola singola richiede spiccata sensibilità di rilevamento, poiché ogni vescicola trasporta soltanto un piccolo numero di recettori. Approcci standard per l'esame di traffico recettore includono biotinilazione superficie seguita da rilevamento biochimiche, che manca sia le necessarie risoluzioni spaziali e temporali, e l'esame al microscopio a fluorescenza di recettori di superficie immunolabeled, che richiede la fissazione chimica delle cellule e quindi manca di sufficiente risoluzione temporale 1-6. Per superare questi limiti, noi e altri hanno sviluppato e utilizzato una nuova strategia che consente la visualizzazione di inserimento dinamico di recettori in PM con eccellenti risoluzioni spaziali e temporali 7-17. Il metodo comprende la codifica di un pH-sensibile GFP, la superecliptic pHluorin 18, al N-terminale del dominio extracellulare del recettore. Superecliptic pHluorin ha la proprietà unica di essere fluorescente a pH neutro e non fluorescente a pH acido (pH <6.0). Pertanto, i recettori sono contrassegnati non fluorescente quando all'interno del lume di vescicole acide traffico intracellulare o compartimenti endosomali, e diventano facilmente visualizzato solo quando esposta all'ambiente extracellulare pH neutro, sulla superficie esterna del PM. La nostra strategia permette quindi di distinguere recettori di superficie PM da quelle che, nell'ambito del traffico vescicole intracellulari. Per raggiungere sufficienti risoluzioni spaziali e temporali, nonché la sensibilità necessaria per studiare il traffico dinamica dei recettori, abbiamo impiegato interna totale rifletteremicroscopia a fluorescenza di ioni (TIRFM), che ci ha permesso di ottenere la risoluzione ottimale spaziale di imaging ottico (~ 170 nm), la risoluzione temporale di video-tasso di microscopia (30 fotogrammi / sec), e la sensibilità per rilevare la fluorescenza di GFP unico molecola. Con immagini pHluorin-tagged recettori sotto TIRFM, siamo stati in grado di visualizzare direttamente i singoli eventi recettore inserimento nel PM in neuroni in coltura. Questo approccio di imaging può potenzialmente essere applicato a qualsiasi proteina di membrana con un dominio extracellulare che potrebbe essere etichettato con pHluorin superecliptic, e consentirà dissezione dei meccanismi principali modalità per l'inserimento di differenti proteine di membrana (recettori, canali ionici, trasportatori, ecc) per il PM.
Protocollo
1. Preparazione Glia Cultura del mouse per Condizionamento Cultura neuronale
- T75 beute sono rivestiti con una soluzione di collagene (1:3 diluizione Purecol in DDH 2 O). Le beute sono in posizione verticale e lasciato asciugare per una notte in una cappa di coltura tissutale.
- Dissezione buffer (aCSF: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 30 mM glucosio, 25 mM HEPES, pH 7,4, senza calcio) e supporti glia (DMEM supplementato con 10% FBS, 10 unità / ml di penicillina, 10 ug / ml di streptomicina, e Glutamax) sono preparati e conservati a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- Il giorno della cultura glia, i media glia vien....
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Discussione
Per ragioni sconosciute, i neuroni di topo sono sempre più difficili da coltivare di neuroni di ratto. Nella nostra esperienza, una coltura mista di neuroni e glia funziona bene per primari neuroni di topo in coltura. Tuttavia, una tale coltura mista non è adatto per esperimenti di imaging TIRF, come in questo tipo di neuroni cultura ei processi tendono a crescere sopra cellule gliali, situando il somata neuronale e processi dendritici fuori dalla portata della microscopia TIRF. Pertanto, una densità minore colture neur.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto da fondi di avvio di The Jackson Laboratory.
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Materiali
Dulbecco Buffered Saline (DPBS)
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente Azienda Numero di catalogo Commenti | |||
| Purificato soluzione di collagene bovino (Purecol) | Avanzate Biomatrix | 5005-B | |
| Hank soluzione salina bilanciata (HBSS) | GIBCO | 14185-045 | |
| Penicillina-streptomicina (Pen Strep) | GIBCO | 15140-122 | |
| Sodio piruvato | GIBCO | 11360-070 | |
| DMEM glucosio Alta | GIBCO | 10313-021 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | |||
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Papaina | Worthington Biochemical Corp. | LS003126 | |
| Ho Deoxyribonuclease dal pancreas bovino (DNasi I) | SIGMA | DN25-10MG | |
| GIBCO | 14190-144 | ||
| Tripsina 0,05% | GIBCO | 25300-054 | |
| Poli-L-lisina bromidrato | SIGMA | P2636-1G | |
| Acido borico | Fisher-Scientifica | BP 168-500 | |
| Medio Neurobasal | GIBCO | 21103-049 | |
| B-27 siero-Free Supplemento | GIBCO | 17504-044 | |
| Siero di cavallo calore inattiva | GIBCO | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher-Scientifica | BP310-500 | |
| Cultura Inserisci | Millipore | PICM03050 |
Riferimenti
- Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and syn....
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Ristampe e permessi
