Etichettando i domini extracellulari dei recettori di membrana con pHluorin superecliptic, e da imaging questi recettori di fusione in neuroni di topo in coltura, si può visualizzare direttamente i singoli eventi di inserzione vescicolari dei recettori della membrana plasmatica. Questa tecnica sarà determinante per chiarire i meccanismi molecolari che regolano l'inserimento recettore alla membrana plasmatica.
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Articolo metodologico
Imaging pHluorin-tagged inserimento recettore alla membrana plasmatica nella Primaria neuroni mouse coltivate
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una migliore comprensione dei meccanismi che regolano il traffico tra il recettore di membrana plasmatica (PM) e compartimenti intracellulari richiede un approccio sperimentale con ottime risoluzioni spaziali e temporali. Inoltre, tale approccio deve inoltre essere in grado di distinguere recettori localizzati sulla PM da quelli in compartimenti intracellulari. Soprattutto, rilevando recettori in una vescicola singola richiede spiccata sensibilità di rilevamento, poiché ogni vescicola trasporta soltanto un piccolo numero di recettori. Approcci standard per l'esame di traffico recettore includono biotinilazione superficie seguita da rilevamento biochimiche, che manca sia le necessarie risoluzioni spaziali e temporali, e l'esame al microscopio a fluorescenza di recettori di superficie immunolabeled, che richiede la fissazione chimica delle cellule e quindi manca di sufficiente risoluzione temporale 1-6. Per superare questi limiti, noi e altri hanno sviluppato e utilizzato una nuova strategia che consente la visualizzazione di inserimento dinamico di recettori in PM con eccellenti risoluzioni spaziali e temporali 7-17. Il metodo comprende la codifica di un pH-sensibile GFP, la superecliptic pHluorin 18, al N-terminale del dominio extracellulare del recettore. Superecliptic pHluorin ha la proprietà unica di essere fluorescente a pH neutro e non fluorescente a pH acido (pH <6.0). Pertanto, i recettori sono contrassegnati non fluorescente quando all'interno del lume di vescicole acide traffico intracellulare o compartimenti endosomali, e diventano facilmente visualizzato solo quando esposta all'ambiente extracellulare pH neutro, sulla superficie esterna del PM. La nostra strategia permette quindi di distinguere recettori di superficie PM da quelle che, nell'ambito del traffico vescicole intracellulari. Per raggiungere sufficienti risoluzioni spaziali e temporali, nonché la sensibilità necessaria per studiare il traffico dinamica dei recettori, abbiamo impiegato interna totale rifletteremicroscopia a fluorescenza di ioni (TIRFM), che ci ha permesso di ottenere la risoluzione ottimale spaziale di imaging ottico (~ 170 nm), la risoluzione temporale di video-tasso di microscopia (30 fotogrammi / sec), e la sensibilità per rilevare la fluorescenza di GFP unico molecola. Con immagini pHluorin-tagged recettori sotto TIRFM, siamo stati in grado di visualizzare direttamente i singoli eventi recettore inserimento nel PM in neuroni in coltura. Questo approccio di imaging può potenzialmente essere applicato a qualsiasi proteina di membrana con un dominio extracellulare che potrebbe essere etichettato con pHluorin superecliptic, e consentirà dissezione dei meccanismi principali modalità per l'inserimento di differenti proteine di membrana (recettori, canali ionici, trasportatori, ecc) per il PM.
Protocollo
1. Preparazione Glia Cultura del mouse per Condizionamento Cultura neuronale
- T75 beute sono rivestiti con una soluzione di collagene (1:3 diluizione Purecol in DDH 2 O). Le beute sono in posizione verticale e lasciato asciugare per una notte in una cappa di coltura tissutale.
- Dissezione buffer (aCSF: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 30 mM glucosio, 25 mM HEPES, pH 7,4, senza calcio) e supporti glia (DMEM supplementato con 10% FBS, 10 unità / ml di penicillina, 10 ug / ml di streptomicina, e Glutamax) sono preparati e conservati a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- Il giorno della cultura glia, i media glia viene riscaldato per almeno 30 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C prima della dissezione del cervello di topo. Topi embrionali o neonatale sono sacrificati per decapitazione rapida. Cortecce cerebrali sono sezionato sotto un microscopio dissezione.
- Tessuti cerebrali sezionati vengono digeriti in soluzione di papaina (100 ml papaina e 20 microlitri DNasi I 1% in 2 ml di tampone dissezione) a 37 ° C for 20 min.
- Dopo la digestione papaina, tessuti cerebrali vengono sciacquati con 10 ml di pre-riscaldate supporti glia. Supporti glia freschi (2 ml) viene quindi aggiunta ai tessuti cerebrali digeriti, ei tessuti vengono triturato con un fuoco lucidato vetro pipetta Pasteur.
- Supporti glia freschi (8 ml) viene aggiunto ai tessuti dissociate. A 70 micron cella-filtro viene utilizzato per filtrare la sospensione dissociato tessuto. Le cellule vengono quindi seminate in fiasche T75 (solitamente 2-3 embrioni possono seme uno beuta T75) e posta in un 37 ° C incubatore per colture cellulari.
- Il giorno dopo, i media dei palloni T75 viene aspirato. Le beute vengono risciacquati con 10 ml di PBS. Supporti glia fresco (10-15 ml) viene poi aggiunto a ciascun contenitore.
- Entro 10-12 giorni, glia nelle T75 flaconi devono essere confluenti. Cellule gliali sono lavate con PBS, e 5 ml di 0,05% tripsina viene aggiunto a ciascuna beuta T75.
- Dopo incubazione tripsina a 37 ° C per 5 minuti, le cellule gliali sono cellule dissociate e gliali da ciascuna beuta T75 sono divisi in duediversi collagene rivestite T75 palloni.
- Inserti Cultura (Millipore PICM03050) sono preparati ponendoli in piastre da 6 pozzetti, rivestimento con collagene, e aria di essiccazione durante la notte. Supporti glia (2 ml ciascuna) si trova sotto ogni inserto cultura.
- Glia da confluenti T75 recipienti vengono tripsinizzate e seminate su gli inserti culturali (uno T75 pallone per piastra da 6 pozzetti, 2 ml ogni inserto). Questi inserti glia cultura saranno utilizzati per il condizionamento delle colture neuronali.
2. Cultura neuronale
- I vetrini per colture neuronali vengono puliti mediante immersione nel 70% HNO3 almeno una notte. Vetrini vengono quindi lavati con DDH 2 O almeno 3 volte, ed essiccato in un forno Isotemp (> 200 ° C) per una notte.
- Coprioggetti puliti sono posti in una piastra da 6 pozzetti, uno coprioggetto per pozzetto. Coprioggetti sono rivestite con poli-L-lisina soluzione (2 ml, 0,1% in 100 mM di acido borico, pH = 8,5) durante la notte in un incubatore a 37 ° C.
- Ilpoli-L-lisina soluzione viene rimossa dai vetrini coprioggetto e vengono lavate 3 volte con autoclavato DDH 2 O. Coprioggetti vengono poi incubate a 37 ° C per una notte in terreni in piastra (Neurobasal supplementato con 5% di siero siero di cavallo, 10 unità / ml di penicillina, 10 mg / ml di streptomicina, Glutamax incubatore; 2% B27 supplemento viene aggiunto al mezzo di placcatura il giorno in cui viene utilizzato).
- Il giorno seguente, i mezzi di placcatura viene rimosso e 2 ml di terreni in piastra freschi con B-27 viene aggiunto a ciascun pozzetto che ha un vetrino coprioggetto.
- Topi in gravidanza (E15-18) sono sacrificati con CO 2, e topi embrionali sono eutanasia per decapitazione. L'ippocampo o striato è sezionato dal tessuto cerebrale e posta in un tubo da 15 ml con tampone ghiacciato dissezione, per la coltura di neuroni ippocampali o neuroni striatali medium spiny, rispettivamente.
- Tessuti cerebrali sezionati sono dissociate con papaina come descritto ai punti 1.4) e 1.5).
- Fopo dissociazione, il numero di cellule in ciascuna sospensione neuronale è conteggiato con un emocitometro. Neuroni vengono quindi seminate su ciascun vetrino ad una densità di 0,4 x 10 6 cellule per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti e coltivate in un incubatore a 37 ° C overnight (neuroni sono DIV 0).
- Per preparare inserti per coltura glia condizionamento le colture neuronali, il supporto viene rimosso dal glia inserti di coltura glia e medie placcatura fresco è aggiunto (2 ml nell'inserto e 2 ml sotto l'inserto).
- Il giorno successivo (DIV 1), coprioggetto con i neuroni sono posti sotto inserti di coltura glia, un vetrino in ciascun pozzetto.
- I neuroni sono alimentati con la metà del volume di nuove pre-riscaldate supporti di alimentazione (con B-27) ogni 3-4 giorni fino a quando non sono pronti per esperimenti di trasfezione e di imaging.
3. Transfection
- Trasfezione neuronale viene eseguita utilizzando Lipofectamine 2000. Per ogni cultura neuronale (una cultura per vetrino), 2 microlitriLipofectamine 2000 e 1 pg di DNA vengono utilizzati. Fresco media Neurobasal senza supplemento viene utilizzato per diluire Lipofectamine e DNA.
- DNA e Lipofectamine sono incubate per 20 minuti a temperatura ambiente dopo la miscelazione.
- Salva 1 ml di mezzi di comunicazione da sotto ogni inserimento cultura glia, e 1 ml da dentro ogni inserimento, e trasferire i media a un tubo conico. Aggiungere lo stesso volume di mezzi di alimentazione + B27 al mezzo salvato e incubare a 37 ° C. Questo mezzo è utilizzato per colture neuronali dopo trasfezione.
- Seguendo il 20-min Lipofectamine / DNA incubazione, inserti di coltura glia vengono rimossi momentaneamente dai piastre da 6 pozzetti. Il 200 pl Lipofectamine / DNA miscela viene aggiunta a ciascun coprioggetto con i neuroni. Gli inserti glia coltura vengono poi restituiti a ciascun pozzetto, sopra i neuroni. Generazione di bolle sotto la membrana di inserti di coltura deve essere evitato. Neuroni sono incubate con l'Lipofectamine / DNA miscela a 37 ° C per 2-4 ore.
- Dopo the 2-4 ore periodo di incubazione, inserti glia vengono rimossi di nuovo. I terreni di coltura con il Lipofectamine / DNA miscela viene rimosso da ogni pozzetto. I media salvati al passo 3.3) è aggiunto neuroni (2 ml per pozzetto). Inserti di coltura glia vengono restituiti a ciascun pozzetto, e il supporto glia di ogni inserto viene rimosso, e 2 ml del terreno di passo 3,3) viene aggiunto in ogni inserto.
- I neuroni sono coltivate per ulteriori 24-72 ore per permettere l'espressione di cDNA trasfettate prima TIRF immagini viene eseguita su questi neuroni.
4. TIRF Imaging
- Artificiale liquido cerebrospinale (aCSF: 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 30 mM di glucosio, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, pH = 7,4) sarà utilizzato per vivo-imaging esperimenti. Il nostro sistema di imaging TIRF è personalizzato set-up con 100 mW Ciano laser per l'eccitazione, e una carica dell'elettrone Moltiplicando Coupled Device (EMCCD) fotocamera per un rivelatore.
- Prima di esperimenti di imaging, il aCSF è avvertito in un 37 & dad esempio, l'acqua bagno C per almeno 30 minuti. L'inserto di riscaldamento per l'imaging in tempo reale viene posto sul piatto microscopio, e l'inserto di riscaldamento, laser, e la fotocamera sono riscaldati per almeno 30 minuti prima dell'inizio degli esperimenti di imaging.
- Un coprioggetto con i neuroni trasfettati viene trasformata in live-imaging camera. Preriscaldata aCSF viene collocato nella camera dopo la camera è assemblato; questo passo dovrebbe essere completata il più rapidamente possibile.
- Una volta che la camera è posizionato sull'inserto riscaldamento sul palco microscopio, neuroni trasfettati sono identificati visivamente sotto epi-fluorescenza modalità di imaging.
- Dopo sani neuroni trasfettati sono identificati (vedi figure 1 e 2), di solito effettuare 1 min di foto-candeggina per eliminare preesistente fluorescenza pHluorin sulla membrana plasmatica, come pHluorin recettori sulla membrana plasmatica hanno livelli di fluorescenza molto elevato quando TIRF immagini è appena partito, che interferisce con la visualizzazione dei singoli componentiertion eventi.
- Dopo fotosbiancante, l'impostazione del guadagno del moltiplicatore di elettroni sulla fotocamera EMCCD è impostato al massimo, e la registrazione viene eseguita per 1 min a 10 Hz.
- Ogni registrazione conterrà 600 immagini. I singoli eventi di inserzione sono identificati giocando dietro registrazione con ImageJ. Eventi di inserimento individuali sono analizzati manualmente utilizzando ImageJ.
5. Risultati rappresentativi
Coerentemente cultura neuronale è la chiave del successo dal vivo-imaging esperimenti. Figura 1 mostra i neuroni dell'ippocampo di topo coltivate utilizzando il nostro protocollo da 11 a DIV DIV 18. E 'chiaro dalle immagini che i neuroni hanno sviluppato processi estensivi e che i processi dendritici sono coperte densamente di spine dendritiche, le indicazioni che questi neuroni sono sani di cultura. Nostro protocollo cultura potrebbe essere utilizzato anche per altri tipi di neuroni nel cervello. Ad esempio, abbiamo recentemente utilizzato questo protocollo alla culturastriatali neuroni spinosi medi in uno studio per esaminare recettore della dopamina D2 (DRD2) inserimento in colture di neuroni striatali medio del mouse spinosi 9. Figura 2 mostra il mouse medie neuroni spinosi striatali coltivate utilizzando il nostro protocollo a DIV 8. Abbiamo anche eseguito con successo TIRF imaging superecliptic DRD2s pHluorin-etichetta in questo tipo di neurone. Figura 3 mostra l'espressione di pHluorin-etichettato DRD2 (pH-DRD2) in un neurone spinoso medio e visualizzazione di pH-DRD2 inserimento in questo neurone.
Figura 1. Mouse cultura hippocampal utilizzando il metodo cultura dell'interfaccia. DIV: giorni in vitro, il giorno della cultura è considerato come DIV 0. Dalle immagini, è evidente che i neuroni ippocampali maturi in questo tipo di coltura tra 11 e DIV DIV 15. A DIV 11 e 13, dendriti neuronali sono coperti di spine filipodia e immaturi. A 15 e DIV18, dendriti neuronali sono coperti di spine di grandi dimensioni, l'indicazione di più neuroni maturi. I pannelli a sinistra: bassa ingrandimento immagini di neuroni ippocampali di topo di diverse età. Pannelli di destra: le immagini ad alto ingrandimento (zoom su dendriti neuronali del pannello di sinistra) di processi neuronali dendritiche con spine dendritiche di diverse età.
Figura 2. Mouse striatale terreno spinoso neurone cultura utilizzando il metodo cultura dell'interfaccia. I neuroni delle immagini sono in DIV 8.
Figura 3. Un neurone striatale topo medio spinoso trasfettate con super eclittica pHluorin-tag del recettore D2 della dopamina (pH-DRD2). Immagine a sinistra è la proiezione massima intensità di un time-lapse (600 immagini, 100 msec per immagine). Frecce bianche indicano individuale inserimento vescicolare del pH-DRD2. Questa immagine conserva le informazioni di inserimento nella dimensione xy ma perde le informazioni sull'ora. Immagine a destra mostra yt sporgenza massima intensità, in cui la pila XYT è ruotato di 90 gradi intorno all'asse y, e il pixel massimo su ciascun asse x linea viene proiettata su un unico asse y pixel. Questa immagine mantiene informazioni inserimento lungo l'asse yt ma perde l'asse x informazioni.
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Discussione
Per ragioni sconosciute, i neuroni di topo sono sempre più difficili da coltivare di neuroni di ratto. Nella nostra esperienza, una coltura mista di neuroni e glia funziona bene per primari neuroni di topo in coltura. Tuttavia, una tale coltura mista non è adatto per esperimenti di imaging TIRF, come in questo tipo di neuroni cultura ei processi tendono a crescere sopra cellule gliali, situando il somata neuronale e processi dendritici fuori dalla portata della microscopia TIRF. Pertanto, una densità minore colture neur...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto da fondi di avvio di The Jackson Laboratory.
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Materiali
Dulbecco Buffered Saline (DPBS)
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente Azienda Numero di catalogo Commenti | |||
| Purificato soluzione di collagene bovino (Purecol) | Avanzate Biomatrix | 5005-B | |
| Hank soluzione salina bilanciata (HBSS) | GIBCO | 14185-045 | |
| Penicillina-streptomicina (Pen Strep) | GIBCO | 15140-122 | |
| Sodio piruvato | GIBCO | 11360-070 | |
| DMEM glucosio Alta | GIBCO | 10313-021 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | |||
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Papaina | Worthington Biochemical Corp. | LS003126 | |
| Ho Deoxyribonuclease dal pancreas bovino (DNasi I) | SIGMA | DN25-10MG | |
| GIBCO | 14190-144 | ||
| Tripsina 0,05% | GIBCO | 25300-054 | |
| Poli-L-lisina bromidrato | SIGMA | P2636-1G | |
| Acido borico | Fisher-Scientifica | BP 168-500 | |
| Medio Neurobasal | GIBCO | 21103-049 | |
| B-27 siero-Free Supplemento | GIBCO | 17504-044 | |
| Siero di cavallo calore inattiva | GIBCO | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher-Scientifica | BP310-500 | |
| Cultura Inserisci | Millipore | PICM03050 |
Riferimenti
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