Insulina Microiniezione ippocampale e<em&gt; In vivo</emMicrodialisi&gt; Durante il test di memoria spaziale

Sommario

Modulazione di hippocampally-dipendente memoria spaziale di lavoro diretto microiniezione intrahippocampal, accompagnato e seguito da In vivo per i metaboliti in animali coscienti che si comportano.

Abstract

Il metabolismo del glucosio è un marker utile per la locale attività neurale, che costituiscono la base di metodi come 2-desossiglucosio e la risonanza magnetica funzionale. Tuttavia, l'uso di tali metodi in modelli animali richiede l'anestesia e, quindi, sia altera lo stato del cervello e impedisce misure comportamentali. Un metodo alternativo è l'uso di microdialisi in vivo per prendere la misura continua delle concentrazioni nel liquido extracellulare del cervello di metaboliti del glucosio, lattato, e relativi in Svegliatevi, animali sfrenato. Questa tecnica è particolarmente utile quando combinato con compiti destinate a ricorrere specifiche regioni cerebrali acute e / o manipolazione farmacologica, ad esempio, le misure ippocampali durante un compito di memoria di lavoro spaziale (alternanza spontanea) mostrano un tuffo in glucosio extracellulare e aumento della lattato che sono indicativo di ^1,2 glicolisi maggiore, e somministrazione di insulina intrahippocampal sia migliora la memoria e aumenta glicole ippocampalelisi ^3. Sostanze come l'insulina può essere consegnato ippocampo tramite la sonda microdialisi stesso utilizzato per misurare metaboliti. L'uso di alternanza spontanea come una misura della funzione ippocampale è stato progettato per evitare di confondere motivatori stressanti (ad esempio footshock), ritenuta, o ricompense alimentari (ad esempio), ciascuno dei quali può alterare sia le prestazioni delle applicazioni e il metabolismo; questa attività fornisce anche un misurare dell'attività motoria che consente il controllo di effetti non specifici del trattamento. Combinati, questi metodi permettono la misurazione diretta delle variabili neurochimiche e metaboliche che regolano il comportamento.

Protocollo

1. Chirurgia Preparazione

1. Gestione. Animali (più comunemente, ratti o topi, anche se il metodo di microdialisi e la combinazione con il test comportamentale è in gran parte di carattere generale con qualsiasi specie-specifici necessari adattamenti necessari, ad esempio per l'anestesia) sono trattati per un minimo di 10 min / giorno per almeno due giorni prima di un intervento chirurgico. Manipolazione estensiva ha dimostrato di lasciare animali in uno stato riposo al momento del test, evitando confondere possibile ^2,4,5. Useremo i ratti nel corso di questo protocollo come una specie di esempio. Movimentazione deve avvenire senza stress causato tirando pellicce di lattice ad esempio, o guanti di nitrile: questo può essere meglio raggiunto con le mani nude, in consultazione con il veterinario struttura e gli ufficiali sanitari dei dipendenti. Se ciò non è possibile, guanti di cotone morbido dovrebbe essere indossata sopra i guanti di barriera per evitare di tirare sulla pelliccia dei topi.
2. Preparazione del campo sterile. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, il Surgiczona al è preparata, un campo sterile preparati attorno dell'apparato stereotassico e una garza sterile posto attraverso l'apparato, che copre una piastra elettrica che viene utilizzato per mantenere la temperatura corporea ratto. Un pad circolare acqua calda con termostato accurata è usato per prevenire il surriscaldamento dell'animale.
3. Anestesia induzione. Il vaporizzatore isoflurano viene controllato per contenere livelli ottimali di isoflurano e collegata alla camera di induzione. Connessioni vengono controllati per confermare un anello chiuso. Il sistema di trattamento aria a vuoto è controllato per essere operativo. Vaporizzazione isoflurano è acceso e l'animale collocato nella camera di induzione con un 5% di isoflurano in ossigeno mix: cioè, 5% isoflurano aggiunto in un flusso di ossigeno al 100% ed erogata nella camera di induzione.
4. Posizionamento in apparecchi. Animali sono fissati nel dispositivo stereotassico utilizzando earbars e un bar dente. Corretto posizionamento earbar risultati in una testa immobile e le orecchie che rimangono piatte lungo le earbars. Animalistanno rapidamente assicurato il naso e inserito in un apposito per anestesia dell'ogiva; consegna di isofluorano vaporizzato viene commutato dalla camera di induzione alla dell'ogiva e la miscela anestetica regolato per fornire 2-3% isoflurano nel flusso di ossigeno andando al musetto.
5. Conferma di anestesia. Un piano chirurgico anestetico viene confermata fornendo un pizzico rigido al piede e un soffio d'aria per l'occhio, né dovrebbe causare alcuna risposta. Tali test vengono ripetuti ad intervalli di circa 15 min durante un intervento chirurgico per confermare il mantenimento di un piano anestetico chirurgico. Capelli viene rimosso dal sito di incisione prima di entrare nel campo sterile.

2. Chirurgia

1. Animal trattamento iniziale. Pomata oftalmica è applicata a ciascun occhio per prevenire l'essiccazione. 1 ml di soluzione salina sterile è dato sc per evitare la disidratazione durante l'intervento chirurgico, e il corpo è coperto con una garza sterile. Betadine viene applicato al cuoio capelluto, e tamponate dal centrocon un tampone di cotone, 70% etanolo tamponato simile, e le due fasi tamponamento sono ripetuti due volte più a garantire un sito appropriato incisione. Tempo di contatto con la pelle per betadine e l'alcool dovrebbe essere di almeno 3 minuti prima dell'incisione. Anestesia è mantenuto e controllato regolarmente durante l'intervento chirurgico, una singola iniezione sottocutanea di carprofen 5 g / kg) è data per avviare analgesia, e viene utilizzata una tecnica asettica. L'analgesia viene dato dopo l'induzione dell'anestesia per ridurre al minimo qualsiasi stress da iniezione.
2. Incisione e la preparazione del cranio. Un taglio 3-4 cm è realizzato sagittale nel centro del cranio. Un mix 1:1 di bupivicaine: adrenalina viene applicato localmente per fornire ulteriore analgesia e ridurre al minimo il sanguinamento. Il cuoio capelluto è tenuto lontano dalla incisione con clips chirurgiche e tamponi sterili sono utilizzati per eliminare le membrane sovrastanti dal cranio. Coordinate per foratura sono misurate utilizzando bregma come punto di riferimento, contrassegnati con una punta sterile trapano (o, in alternativa, un palmare cautery device), e riconfermato per la precisione prima di iniziare la perforazione. Coordinate per specifiche regioni cerebrali di interesse (ad esempio qui l'ippocampo) sono determinati utilizzando un atlante del cervello. Per microdialisi ippocampale, usiamo un sito di perforazione a 5.6 mm posteriormente al bregma, 5,0 laterale, ventrale e 3.0 da dura.
3. Foratura. Tre fori sono realizzati attraverso il cranio, avendo cura di applicare solo una forza minima tale che il trauma alla dura madre e le membrane sottostanti è minima o assente. Un foro è misurata nel sito di inserimento cannula, gli altri due sono posizionati come conveniente per l'inserimento di viti cranio. Scopo di dimensioni viti (ad esempio 1,17 millimetri viti autofilettanti; Strumenti Scienza Arti) sono inseriti in questi fori, senza impatto sul cervello di sotto, e sono utilizzati come punti di ancoraggio per la successiva applicazione del cemento dentale.
4. Cannula posizionamento e chiusura. La cannula è posizionato a inserimento coordinate, che vengono ri-confermato essere il sito del foro forato,e viene quindi abbassato lentamente alla profondità bersaglio. Una volta posizionato correttamente, la cannula viene fissato con cemento dentale. Se necessario, una singola sutura sterile chirurgica viene utilizzata per chiudere la ferita. Un mandrino viene inserita nella cannula per mantenere la pervietà. In questo protocollo si usa una sonda CMA12 e guida cannula (CMA / microdialisi).
5. Acuta cura post-chirurgica. 3 ml di soluzione salina sterile è dato sc continuare idratazione; una singola iniezione sottocutanea di carprofen 5 g / kg) è dato anche per avviare analgesia. Animali vengono rimossi dal dispositivo e posto in una camera di recupero riscaldato, in una gabbia pulita, e monitorato finché non sono completamente recuperato da anestesia. Pieno recupero è valutata da un ripristino di raddrizzare locomozione riflessa e normale. Gli animali vengono poi tornò a casa loro gabbia e sala regolare svolgimento.
6. A breve termine di follow-up. Gabbie di animali che hanno subito interventi chirurgici sono contrassegnati con la data di un intervento chirurgico. Gli animali sono controllati almeno una volta al giorno per almeno three giorni dopo l'intervento, e dato un carprofen compresse masticabili (2 mg) il giorno dopo l'intervento chirurgico e ciascuno dei due giorni successivi. Se gli animali non consuma la carprofen, carprofen iniettabile può essere somministrato a garantire un'adeguata analgesia. Monitorare sia lo stato di salute dell'animale e lo stato della ferita (per infezione, arrossamento, ecc), le linee guida istituzionali per la cura degli animali e la ricerca di consulenza e assistenza da parte del personale cura degli animali o il veterinario, se necessario. È importante sottolineare che, si noti che la gestione corretta e acclimatazione per lo sperimentatore è fondamentale: gli animali devono essere trattati ampiamente, tra cui la manipolazione della cannula, fino a quando nessun segno di nervosismo o di stress rimane quando maneggiato dallo sperimentatore.
7. Cura degli animali e il trattamento successivo. Animali seguirà adeguate procedure di prova e l'eutanasia secondo il protocollo approvato e di specifico gruppo sperimentale.

3. Microdialisi (mD)

1. Perfusmangiato preparazione. Artificiale liquido extracellulare (AECF) è realizzato con 153,5 mM Na, K 4,3 mm, 0,41 mM Mg, Ca 0,71 mm, 139,4 mm Cl, 1,25 mM di glucosio, tamponata a pH 7.4 ⁶ NOTA che la composizione del liquido accurata è fondamentale:. Inesattezze o utilizzare di altri fluidi fisiologici meno come Ringer o PBS per microdialisi darà luogo a risultati erronei marcatamente ^6. Specificamente, si noti che la composizione ionica del liquido extracellulare (ECF) non è la stessa di quella del CSF, come mostrato in uno studio del 2004 dettagliato del ECF hippocampal ^6. Il giorno del test, albumina di siero bovino (BSA) deve essere aggiunto al 2% peso / peso e completamente dissolto, il che riduce la perdita di peptidi come insulina da aderenza al tubo, e riduce il rischio di perdita di fluido (ultrafiltrazione) alla membrana della sonda. Dopo la preparazione, il perfusato deve essere filtrata attraverso un filtro di 0,2 micron.
2. Se un trattamento come l'insulina deve essere consegnato al reggisenonella regione di interesse (qui l'ippocampo), preparare questo trattamento utilizzando una aliquota della AECF preparata con la concentrazione del farmaco appropriato. Per l'insulina, una concentrazione di 400 nM (66,7 μU / pl) per la consegna tramite microdialisi contabile sia stato mostrato di influenzare metabolica ippocampale e la funzione cognitiva ^7. Si noti che la concentrazione tissutale risultante di insulina non è misurata e qui rimane sconosciuto.
3. Impostazione della sonda mD e linee. Preparare una sonda fresca microdialisi e la linea il giorno prima del test. Creare due linee separate per "afflusso" e "uscita". Utilizzare PE50 tubi per collegare due pezzi 1 metro di tubo FEP e garantire che vi sia minimo spazio morto tra le righe. Collegare il tubo di afflusso a una siringa da 1 ml Hamilton pieno filtrata sterile, deionizzata H ₂ 0 ₍₂ 0 dH), e quindi collegare alla sonda.
4. Microdialisi girevole. Per consentire la libera circolazione degli animali durante le misure, collegare un girevole liquido al inflow e linee di deflusso, vicino alla pompa, utilizzando tubi FEP supplementare. Ricordarsi di prendere il volume interno di questo girevole e tubi in considerazione nel considerare tempo di raccolta del campione (in basso).
5. Impostazione della pompa mD. Accendere la pompa di mD e correre a 1,5 microlitri / min fino a visualizzare dH ₂ 0 in uscita dal tubo di efflusso sulla sonda. Poi, mentre la pompa è spenta, collegare l'altra linea tra il tubo di efflusso e di un tubo di raccolta del campione. Esegui 5 ml attraverso il tubo e posizionare la sonda in un flaconcino contenente sterile dH ₂ 0 durante la notte, in modo che la punta della sonda rimane sempre bagnato.
6. Pre-sondaggio soggetto del test. 24 ore prima della prova, rimuovere il mandrino manichino dalla testa del ratto e inserire una sonda mD (utilizzato solo per questo scopo, non per il campionamento) per 10 min. Quindi sostituire il mandrino manichino e mettere il ratto di nuovo nella sua gabbia. Questa procedura è progettato per minimizzare qualsiasi effetto di gliosi reattiva il giorno della prova ⁸ e nelle nostre mani, questo dà buona Results che corrispondono dati da altre tecniche e sembrano riflettere l'attivazione ippocampale ^2,5,7,9, altri hanno utilizzato un approccio simile che lascia la sonda in posizione per 24 ore prima della misura, che è anche un buon approccio se danni sonda overnight può essere evitato.
7. Sonda equilibrio. Il giorno della microdialisi, riempire la siringa Hamilton e fiala di scintillazione con AECF filtrato e pompare fino alla equilibrare per 1 ora. Se necessario, riempire una seconda siringa Hamilton con trattamento preparato (per esempio, insulino-AECF) e posto nella pompa a siringa.
8. Sonda inserimento. Quando equilibrio, rimuovere il mandrino manichino e inserire delicatamente la sonda equilibrato mD nel cervello del topo attraverso la cannula. Posizionare il topo in una scatola di plastica trasparente che contiene alcune di biancheria da letto casa del ratto. Assicurarsi che per controbilanciare il tubo: collegare un tubo da microcentrifuga 1,6 ml riempito con acqua per il tubo esterno della gabbia, in modo che la gravità mantiene la microdilinee ALISI unkinked ma non teso. Lasciate sonda equilibrare nel ratto per 2 ore. All'inizio di questo periodo, confermano che il flusso di perfusato è sbloccato: questo è fatto più facilmente attraverso la raccolta di deflusso perfusato un periodo definito e pesatura del campione per confermare che il volume è prevista l'uscita dal sistema. Ogni sonda che rese <90% del volume previsto, e non auto-correggersi dopo la rimozione e il reinserimento, deve essere sostituita (altrimenti edema in corrispondenza della punta della sonda risulterà). Se il flusso è sempre basso o assente, controllare tutte le connessioni per evitare le fuoriuscite in mancanza di questo, scollegare tubi in fasi per vedere se il blocco può essere isolato. Se il problema non viene identificato, sostituire la sonda, se il problema non viene risolto, può essere necessario per ripartire con la nuova sonda e le linee della sezione 3.3. Il periodo di due ore equilibrazione consente la barriera emato-encefalica per sigillare attorno alla sonda ed evitare qualsiasi effetto acuto di inserimento della sonda.
9. Raccolta campioni. Assicurarsi che il correlation tra dialisi campione (dal cervello) e raccolta (nel tubo) è accuratamente calcolato. Ad esempio, utilizzando due metri di tubo FEP tra girevole e sonda, vi è un volume totale tra sonda e raccolta di 30 microlitri e quindi in 20 minuti a 1,5 microlitri / min portata del campione di passare attraverso le sonde, tubi, connettori e ruotare per raggiungere la fine del tubo per la raccolta. Quando i campioni di raccolta in modo che il volume si raccolgono abbastanza per avere la concentrazione necessaria per i vostri saggi. Qui, useremo 5 bin campione min, e quindi raccogliere 7,5 ml di dialisato in ogni provetta di raccolta.
10. Baseline campioni. Una volta che equilibrio è completo, avviare la raccolta del campione. Raccogliere almeno tre campioni il ratto è a riposo nella camera di casa per stabilire una linea di base stabile di misurazioni
11. Trattamento di temporizzazione. Fare attenzione a calcolare tempi necessari per l'inizio del trattamento prima dell'esperimento: ricordate che così come vi è un lasso di tempo tra la dialisie di raccolta del campione, c'è un ritardo (solitamente identiche) tra perfusato lasciando la siringa e l'arrivo al ippocampo dell'animale. Quindi, nella nostra configurazione con un volume di 30 microlitri tra siringa e sonda, cambiare la siringa che contiene trattamento perfusato 20 minuti prima che si desidera che il trattamento per iniziare arrivare al ippocampo.
12. Modifica delle siringhe. Un interruttore di liquido può essere utilizzato, se desiderato, ma non è necessario: al momento opportuno, è sufficiente scollegare la linea di afflusso del controllo perfusato siringa e rapidamente connettersi al trattamento perfusato siringa. Questo non dovrebbe richiedere più di 5 secondi per evitare l'interruzione significativa al flusso di perfusione. Noti che questo processo deve essere invertita dopo il dosaggio desiderato è stato consegnato, se un tempo limitato la prestazione dei trattamenti si desidera. In alternativa, il trattamento può continuare per la durata del campionamento (vedi Figura 2). Le bolle d'aria non deve essere introdotto nella linea durante la commutazione disiringhe, come possono accumularsi in membrana di dialisi e ridurre l'efficienza della sonda.
13. Test comportamentale. Se si esegue un compito comportamentale, seguire tale procedura (vedi punto 4). NOTA che il coordinamento con la consegna di un trattamento per l'ippocampo è importante. Per esempio, la consegna di insulina deve essere programmato per essere 10 min prima di iniziare test ^10. Quindi, il passaggio a un insulina contenente perfusato deve avvenire 30 minuti prima del test comportamentale (20 min per perfusato di passare attraverso le linee più 10 min tempo di consegna prima del test desiderato).
14. Completamento della raccolta del campione. Dopo aver raccolto i campioni desiderati, rimuovere delicatamente la sonda dalla testa dell'animale, ricordando ancora una volta di prendere in considerazione intervallo di tempo tra la dialisi e la raccolta del campione. Rispedire l'animale verso la sua gabbia casa e osservare da vicino per qualsiasi post-sperimentale cambiamento nella salute o nel comportamento fino a quando l'animale viene ucciso e il cervello rimosso per confermare la correttaposizionamento della sonda. Se il sacrificio non si verificherà immediatamente, riportare il mandrino manichino alla cannula per evitare l'introduzione di corpi estranei.
15. Analisi. La metodologia analitica varia a seconda dell'analita (s) di interesse. Poiché campionamento dialisi non consente di equilibramento analita completa alla membrana della sonda, concentrazioni del campione deve essere corretta per ottenere concentrazioni ECF utilizzando la zero-net-flux metodo ^11,12.

4. Test comportamentale

1. Posizionamento su labirinto. Dopo i campioni di base (vale a dire, dopo almeno tre campioni hanno completato la dialisi, ma potrebbe essere ancora nel tubo di deflusso vengono raccolti), spostare delicatamente il topo all'interno dell'apparecchio di test comportamentale. Qualsiasi attività appropriata può essere utilizzato; i dati della figura 1 sono stati raccolti usando un quattro bracci plus-maze forma e misura alternanza spontanea, che è una misura della memoria di lavoro spaziale: il ratto viene posto inizialmente nel center del labirinto e ha permesso di esplorare liberamente ^9,13. Perché qualsiasi test comportamentale può essere utilizzato, il focus di questo protocollo non è il compito specifico utilizzato come esempio (che è dettagliato altrove ^9,14,15), ma in breve, gli animali sono permesso di esplorare il labirinto (il periodo di la scatola grigia in figura 1) e usare hippocampally processi dipendenti di conservare memoria di bracci che sono stati recentemente visitati.
2. Dialisi movimento tubo durante la prova. Tenere il tubo in modo tale che si muove liberamente, né ostacolare il movimento del ratto né essere consentito di muoversi di fronte dell'animale e distrarlo. Rimanere sul posto e ridurre al minimo il proprio movimento in modo da non influenzare il comportamento del ratto.
3. Continua la raccolta dei campioni. Come durante basale, spostare il tubo di efflusso di un tubo di raccolta nuova ogni 5 min.
4. Alternanza test. Permettere agli animali di esplorare liberamente il labirinto per 20 min. Registrare la sequenza e la tempistica di voci braccio o utilizzandouna registrazione video o con le mani per una successiva analisi prestazioni dell'attività ^9,15.

5. Post-test

1. Raccolta dei campioni finali. A seguito di test, rimuovere delicatamente dal labirinto ratto e tornare alla camera di controllo. Continua la raccolta dei campioni microdialisi per almeno quattro campioni per coprire il periodo di recupero da prestazioni dell'attività.
2. Sonda rimozione. Dopo che tutti i campioni sono stati raccolti, rimuovere delicatamente la sonda dalla testa dell'animale e riporre in un flaconcino di stoccaggio; rispedire l'animale verso la sua gabbia casa.
3. Sonda stoccaggio. Dopo il ritorno degli animali alla gabbia a casa e completando la raccolta di qualsiasi residuo dialisato, sciacquare la sonda a fondo con dH ₂ 0 e conservare in una fiala di scintillazione pieno di dH ₂ 0 e coperto con parafilm. Lavare il tubo passando ad una siringa contenente una soluzione di 1:10.000 Kathon in dH ₂ 0 per prevenire la crescita microbica. Le sonde possono essere riutilizzati purché mantenere un buon flusso e hannonessun danno alla membrana, con attenzione questo dovrebbe normalmente essere superiore a dieci impieghi.
4. Istologia. Uccidete l'animale e rimuovere il cervello. Slice su un criostato e utilizzare i normali tecniche istologiche (es. colorazione violetto cresolo) per confermare il corretto posizionamento della sonda.

Risultati

Ratti dovrebbe recuperare rapidamente da un intervento chirurgico e di essere attenti, mobili e attiva entro 30 minuti dopo la cessazione di anestesia. L'impatto del tappo cannula deve essere minimo se l'operazione viene eseguita in modo pulito e minimal cemento dentale viene utilizzato. Se uno qualsiasi segno di infezione si nota durante il monitoraggio post-operatorio, o il ratto è in alcun modo mostrare segni di sofferenza o disagio, interrompere immediatamente l'esperimento, questo dovrebbe essere estrem...

Discussione

Tutte le soluzioni utilizzate in microdialisi deve essere filtrata immediatamente prima dell'uso, utilizzando un filtro di 0,2 micron. Dopo l'inserimento della sonda nella cannula guida, osservare per confermare che il flusso è libero e la raccolta del campione è in corso. Se il flusso si interrompe dopo l'inserimento, la causa più probabile è un danno alla membrana della sonda causata da insufficiente attenzione all'inserimento, e una sonda fresca deve essere sostituito.

Com...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
			La maggioranza dei reagenti sono a livello di laboratorio standard e può essere ottenuto da un fornitore di scelta. Allo stesso modo, apparecchiature come pompe a siringa e tubi possono essere utilizzati da qualsiasi di vari produttori. Elementi specifici utilizzati qui per i cui dettagli sono importanti includono:
CMA 12 microdialisi sonde	CMA / microdialisi	CMA-12-XXX	Questi sono disponibili in lunghezze diverse membrane e tagli, indicati dai codici specifici nel 'XXX'.
L'insulina umana (Humulin)	Eli Lilly	N / a
Girevole Liquid	Instech	375/D/22QM	Questa specifica girevole ha una coppia molto bassa e volume interno, così come un nonreactive rivestimento quarzo.